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Volumen XXV, Número 2
Revista de Ciencias Biológicas y de la Salud
http://biotecnia.unison.mx Universidad de Sonora
ISSN: 1665-1456
165
*Autor para correspondencia: Mónica Sparo
Correo electrónico: msparo@salud.unicen.edu.ar
Recibido: 23 de septiembre de 2022
Aceptado: 10 de marzo de 2023
Inhibición de adhesión bacteriana en catéteres vasculares por el péptido
antimicrobiano AP7121
Inhibition of bacterial adherence to vascular catheters by the antimicrobial peptide AP7121
Sabina Lissarrague1, Laureano Schofs2, Mariana Bistoletti1, Leonardo García Allende3, Andrea Lallée1, Beatriz
Baldaccini1, Sergio Sánchez Bruni2, Mónica Sparo*1
1 Facultad Ciencias Médicas, Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires, Argentina;
2 Laboratorio de Farmacología, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos
Aires, Argentina- CIVETAN- CONICET;
3 Hospital Privado de Comunidad de Mar del Plata, Argentina.
RESUMEN
Las infecciones del torrente sanguíneo asociadas a los cui-
dados de la salud constituyen una de las principales causas
de morbilidad y mortalidad. La infección relacionada con ca-
téteres vasculares es su fuente principal. Las bacterias Gram
positivas, especialmente Staphylococcus spp., constituyen
uno de los agentes etiológicos más frecuentes. Objetivo: eva-
luar la actividad inhibitoria del AP7121 sobre la adherencia
de Staphylococcus aureus en catéteres vasculares. Se utilizó
la cepa productora de biolm S. aureus ATCC 35556 (SA). Se
estimó CIMAP7121 para SA, se inocularon segmentos de 20 mm
de catéter vascular (n = 3) con 104 UFC mL-1 de SA. Se proba-
ron tres esquemas diferentes (A: simultáneo, B: anterior y C:
después del desafío bacteriano) utilizando 1 x CIMAP7121. Se
incluyeron grupos de control en cada esquema. La CIMAP7121
fue 0,48 mg/L. Con los esquemas A y B se logró una reducción
de 2 logaritmos que representa una disminución del 99 % de
células viables. El tratamiento posterior a la exposición con
AP7121 (esquema C) produjo una reducción de 1 logaritmo
que representa una disminución del 90 % de células viables.
Estos resultados sugieren una rápida actividad antimicro-
biana de AP7121 que podría ser beneciosa para reducir la
adherencia bacteriana en catéteres vasculares.
Palabras claves: péptido antimicrobiano AP7121, catéter
vascular, adhesión bacteriana, inhibición
ABSTRACT
Healthcare-associated bloodstream infections are the
leading cause of morbidity and mortality in hospitalized
patients. Vascular catheter-related infection is its main sou-
rce. Gram-positive bacteria, mainly Staphylococcus spp., are
the most prevalent etiological agents. Our aim was to assess
the inhibitory activity of the AP7121 on the Staphylococcus
aureus adherence in vascular catheters. The biolm-producer
strain S. aureus ATCC 35556 (SA) was used. MIC AP7121 for SA was
performed using 20 mm segments of the vascular catheter (n
= 3) were inoculated with 104 UFC∙mL-1 of SA. Three dierent
treatment schemes (A: simultaneous, B: previous, and C:
following bacterial challenge) using 1 x MIC AP7121 were tested.
Control groups were included in each scheme. The MICAP7121
was 0.48 mg/L. A reduction of 2log10 representing a decrease
of 99 % of viable SA cells was achieved with schemes A and
B. The post-challenge treatment with AP7121 (scheme C)
produced a reduction of 1log10 representing a 90 % decrease
of viable SA cells. The results observed in this work suggest
an AP7121 fast-antimicrobial activity that could be benecial
to reduce bacterial adherence on medical devices such as
vascular catheters.
Keywords: antimicrobial peptide AP7121, vascular catheter,
bacterial adherence, inhibition
INTRODUCCIÓN
En el mundo las infecciones sanguíneas asociadas a los
cuidados de la salud constituyen una causa importante de
morbilidad y mortalidad. Las más frecuentes son primarias y
están relacionadas con los catéteres vasculares. Las bacterias
Gram positivas, especialmente Staphylococcus spp., son los
agentes más frecuentes (74 - 92 % del total). Las bacterias se
adhieren a las supercies abióticas formando biopelículas
(biolms) que los preservan de la eliminación mecánica, de
los antimicrobianos sistémicos y del sistema inmune del
huésped.
Las biopelículas están conformadas por comunidades
complejas de microorganismos que están adheridos ge-
neralmente a supercies sólidas o líquidas y embebidos en
una matriz exopolisacárida y, surgen como una estrategia
de supervivencia en ambientes hostiles. Las infecciones re-
lacionadas con biopelículas tienen un signicativo impacto
clínico (65 – 80 % del total). Las biopelículas están implicadas
en las infecciones relacionadas con el uso de dispositivos
biomédicos. La inhibición de formación de biopelículas cons-
tituye la principal estrategia de prevención de bacteriemias
relacionadas con catéteres intravasculares (Gahlot et al, 2014;
Wallace et al., 2017).
Actualmente los catéteres intravasculares pueden im-
pregnarse con antibióticos para disminuir la incidencia de
infecciones en pacientes críticos (Donelli y Francolini, 2001).
Este uso conlleva el riesgo de inducir la emergencia de cepas
multirresistentes o la infección en el paciente por bacterias
resistentes al antibiótico impregnado en el catéter.
DOI: 10.18633/biotecnia.v25i2.1858
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De acuerdo a la Organización Mundial de la Salud la ma-
yoría de las drogas en desarrollo son modicaciones de anti-
bióticos existentes, ofreciendo benecios a corto plazo en el
tratamiento de las enfermedades infecciosas producidas por
bacterias con multirresistencia a los antimicrobianos (Inoue y
Minghui, 2017). Por lo tanto, se ha prestado especial atención
a la evaluación de la aplicación de péptidos antimicrobianos
de origen bacteriano para la atención de pacientes, por su
ecacia y velocidad bactericida in vitro (Cavera et al., 2015;
Delpech et al., 2017).
Enterococcus faecalis CECT7121 (depositada en la Co-
lección Española de Cultivos Tipo, CECT, Burjasot, Valencia,
España) es una cepa probiótica productora de un péptido
antimicrobiano de 4726 Da con actividad bactericida sobre
bacterias Gram positivas denominado AP7121 (Sparo et al.,
2006; 2009; Delpech et al., 2017; Delpech et al., 2019).
Previamente, se ha demostrado la actividad anti-
biopelícula in vitro de AP7121 sobre múltiples aislamientos
de origen clínico de Staphylococcus aureus y S. epidermidis
multirresistentes y la prevención de formación de biopelícu-
las por estas bacterias en una supercie abiótica (Delpech et
al., 2020).
El objetivo de este trabajo fue determinar la actividad
inhibitoria de adhesión bacteriana sobre catéteres intra-
vasculares utilizados en Medicina Humana mediante expe-
rimentos de tratamiento con AP7121 previo, simultáneo o
posterior al desafío con una cepa de colección internacional
productora de biopelícula.
MATERIALES Y MÉTODOS
Producción del péptido AP7121
Se aisló AP7121, siguiendo la metodología descripta pre-
viamente (Sparo et al., 2009). En resumen, se incubó la cepa
probiótica E. faecalis CECT7121 a 35 ± 2 °C, durante 18 h, en
caldo infusión cerebro-corazón (BHI, Laboratorio Britania,
Buenos Aires, Argentina). Se inoculó el cultivo en 4 L de caldo
BHI e incubó a 35 ± 2 °C, durante 9 h. Luego, se centrifugó a
15.000 g, a 4 ºC, durante 20 min. El sobrenadante se ajustó a
pH: 7,0 y se precipitó de acuerdo a Dawson et al. (1969). Se
centrifugó a 20.000 g, a 4 ºC, durante 20 min. El precipitado
se re-suspendió en 40 mL de buer fosfato salino (PBS), 5
mM, pH: 7,0. El péptido AP se aisló mediante una extracción
físico-química, empleando cartuchos Sep-Pak™ C18 (Waters,
Milford, EE.UU.). El extracto de E. faecalis (5 mL) se cargó en
un cartucho, lavado previamente con acetonitrilo en ácido
triuoro acético (TFA, 0,1 %) y se eluyó con acetonitrilo (60
%)-TFA (0,1 %). El eluato se evaporó a sequedad utilizando
una centrífuga de vacío (ThermoSavant Instuments, Holl-
brook, EE.UU.). Se re-suspendió el precipitado en PBS (250
μL). Se inyectaron alícuotas de la suspensión (20 μL) en un
sistema HPLC de fase reversa (Shimadzu, Kyoto, Japón) y se
separaron en una columna Nucleosil C18 (5 μm, Pharmacia,
Uppsala, Suecia). Fase móvil: buer A (TFA 0,1 %) y buer B
(acetonitrilo 95 % en TFA 0,1 %). AP se eluyó en un gradiente
lineal (95 % A/5 % B a 15 % A/85 % B), con una tasa de ujo
de 0,2 mL/min, controlando la elución con un detector UV.
Se recolectaron las fracciones en períodos regulares. Se
evaporó la fracción activa hasta sequedad y se re-suspendió
en buer fosfato (50 mM, pH: 7,0). Se determinó la actividad
inhibitoria sobre S. aureus ATCC 35556 por el método de
difusión en pocillos previamente descrito (Sparo et al., 2009).
Se detectó actividad biológica de AP7121 luego de 30 min
de la inyección de la muestra, con aproximadamente 40 %
de buer B. Se determinó la concentración de AP7121 (Kit de
ensayo de proteínas Pierce™ Coomassie, Thermo Scientic™).
Finalmente se liolizó hasta su posterior análisis.
Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima
(CIMAP7121)
Se utilizó para el ensayo la cepa formadora de biopelícula S.
aureus ATCC 35556, SA (Seidi et al., 2008).
Se determinó la CIMAP7121 de SA mediante el micro-
método de dilución en caldo. Brevemente, una colonia de SA
(desarrollo de 18 h en agar BHI) se inoculó en caldo BHI y se
incubó durante 18 h a 35 ± 2 ºC. Posteriormente cada aisla-
miento se inoculó en un caldo BHI fresco y se incubó hasta
una absorbancia de 0,05 a 595 nm de longitud de onda. Alí-
cuotas (20 µL) de diluciones seriadas de AP7121, en un rango
de 0,25 mg/L a 64 mg/L, se agregaron a cada pocillo de las
placas estériles (96 pocillos) que contenía 80 µL del cultivo de
cada aislamiento. Se incubó a 35 ± 2 ºC durante 24 h con agi-
tación continua y se leyó la absorbancia a 595 nm. Se denió
la CIM como la menor concentración de AP7121 que inhibió
completamente el desarrollo bacteriano. Se efectuaron tres
experimentos por duplicado.
Determinación del tiempo de contacto
Se utilizaron segmentos (20 mm) de catéteres intravasculares
(CV) de poliuretano (BILUM S, KFF S.A.; Argentina). Cada una
de las secciones del CV se colocó en una solución de AP7121
durante 4, 2, 1 h, 30 min. Todas las muestras fueron procesa-
das por duplicado. Cada sección del catéter se introdujo en
la solución de AP7121 de forma que todas las muestras com-
pletaran su contacto requerido al mismo tiempo. Luego los
segmentos se transrieron a tubos conteniendo 104 UFC∙mL-1
de la cepa S. aureus ATCC 35556, siguiendo el procedimiento
descrito en el Protocolo B. Se realizaron tres experimentos por
duplicado.
Estudios de adhesión en catéter
Para los estudios de adhesión en CV se ensayaron tres proto-
colos (A, B y C).
Protocolo A = Se sumergieron 3 segmentos (20 mm) de
CV en una solución de AP7121 de concentración nal CIMx1
y aproximadamente 104 UFC mL-1 de la cepa.
Protocolo B = tres segmentos de CV se pre-incubaron
durante el tiempo óptimo de contacto, establecido previa-
mente, con una solución de AP7121 CIMx1 de concentración
nal y luego los segmentos se transeren a tubos contenien-
do 104 UFC∙mL-1 de la cepa.
Protocolo C = tres segmentos de CV fueron pre-incuba-
dos con la cepa (104 UFC mL-1) durante 3 h, y se agregó el
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AP7121 a concentraciones nal de CIMx1.
Como controles en cada protocolo se agregó un grupo
con CV no tratados con AP7121.
Las muestras de los protocolos A, B y C se incubaron du-
rante 18 h a 37 ºC. Posteriormente los segmentos de CV fue-
ron lavados dos veces en BF y las bacterias fueron eliminadas
mediante sonicación durante 5 min (Sonic Fisher Scientic,
500). Se determinó el número de células viables mediante
recuento bacteriano en agar y se relacionó con el área de
supercie del catéter. Los experimentos fueron realizados
tres veces por duplicado.
Análisis estadístico
Los resultados se presentaron como media ± DE (desviación
estándar). Los resultados se sometieron a análisis de varianza
y, cuando era apropiado, a la prueba de Kruskal-Wallis para
examinar la existencia de diferencias. Los valores se conside-
raron signicativamente diferentes entre sí cuando p < 0,05.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En la cepa S. aureus ATCC 35556 se obtuvo una CIMAP7121= 0,48
mg/L. El tiempo mínimo óptimo de contacto del péptido con
el CV fue de 2 h ya que se observó un descenso signicativo
de las células viables (Tabla 1).
En relación a los estudios de adhesión al catéter, como se
muestra en la Tabla 2 y en la Figura 1, se observó un descenso
signicativo de bacterias viables (p < 0,001) de S. aureus en 2
log10 (99,0 % de la población) cuando se agregó el péptido
con la bacteria (A) y antes (2 h) de la adhesión bacteriana (B).
En el protocolo C el descenso de viables también fue signi-
cativo (p < 0,01) ya que el descenso de viables fue de 1 log10
(90 % de la población).
Los grupos en riesgo por cateterización venosa de larga
duración son los pacientes con quimioterapia, prematuros,
trasplantados de precursores de células hematopoyéticas,
con alimentación parenteral, dializados (Pitiriga et al., 2020).
En este contexto, se planteó como objetivos generales: In-
vestigar la potencial aplicación del péptido antimicrobiano
AP7121 en Medicina Humana, focalizando los estudios en la
actividad inhibitoria de AP7121 sobre la adhesión de bacte-
rias a dispositivos médicos como son los catéteres vasculares.
Hasta el momento, la investigación para el desarrollo
de péptidos antimicrobianos con nes terapéuticos se ha
enfocado en bacteriocinas como nisina, lacticina y lisostana
(Hassan et al., 2012). La bacteriocina más estudiada, nisina,
se ha propuesto como barrera antimicrobiana porque pue-
den adsorberse en las supercies y prevenir la adhesión
bacteriana (Bower et al., 2001). De hecho, la adhesión de tres
bacterias médicamente relevantes (S. aureus, S. epidermidis
y E. faecalis) se inhibió signicativamente tubos de succión
tratados con nisina (Bower et al., 1998). Godoy-Santos et al.
(2018) demostraron que la nisina producía permeabilización
de la membrana de bacterias sésiles y mostró concordancia
entre la pérdida de viabilidad y la pérdida de integridad de la
membrana.
En ensayos in vitro realizados con las bacteriocinas Pep5
y epidermina se observó una disminución signicativa en el
número de células viables de S. epidermidis adheridas a caté-
teres intravasculares de silicona (Fontana et al., 2005).
S. aureus puede formar biopelículas sobre diversos bio-
materiales y son responsables de infecciones recurrentes en
pacientes hospitalizados por tiempo prolongado (Nan et al.,
2015). Las biopelículas maduras son de difícil erradicación,
complicando el tratamiento del agente patógeno (Dosler y
Mataraci, 2013). AP7121 impide la colonización de S. aureus
sobre CV y por lo tanto también constituye una potencial
herramienta para la prevención de infecciones por formación
de biopelículas.
Tabla 1. Determinación del tiempo de pre-incubación de CV con AP7121.
Table 1. Determination of CV pre-incubation time with AP7121.
Protocolo
Pre-incubación
(horas)
S. aureus
Control
(Log10 UFC/mm-2)
S. aureus
+ AP7121
(Log10 UFC/mm-2) Valor de pa
4 h 6.42 ± 0.08 4.31 ± 0.09 p < 0.001
2 h 6.35 ± 0.10 4.28 ± 0.08 p < 0.001
1 h 6.27 ± 0.12 5.79 ± 0.11 p > 0.05
30 min 6.36 ± 0.13 6.29 ± 0.10 p > 0.05
Los resultados se presentan como media ± desviación estándar.
aANOVA y Kruskal-wallis test.
Tabla 2. Efecto de AP7121 sobre la adhesión a CV de S. aureus ATCC 35556.
Table 2. Eect of AP7121 on S. aureus ATCC 35556 adhesion to CV.
Protocolo S. aureus
Control
(Log10 UFC/mm-2)
S. aureus
+ AP7121
(Log10 UFC/mm-2)
Valor de pa
A 6.18 ± 0.06 4.11 ± 0.05 p < 0.001
B 6.12 ± 0.12 4.01 ± 0.08 p < 0.001
C 6.31 ± 0.11 5.27 ± 0.13 p < 0.01
Los resultados se presentan como media ± desviación estándar.
aANOVA y Kruskal-wallis test.
Figura 1. Efecto de AP7121 sobre la adhesión a CV de S. aureus ATCC 35556.
*** p < 0.001; ** p < 0.01. A, B, C: Protocolo A; Protocolo B; Protocolo C.
Figure 1. Eect of AP7121 on S. aureus ATCC 35556 adhesion to CV.
*** p < 0.001; ** p < 0.01. A, B, C: Protocol A; Protocol B; Protocol C.
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Este estudio mostró que AP7121 previene la coloniza-
ción de S. aureus productor de biopelícula en una supercie
inerte como son los CV. El análisis del recuento de células
viables mostró diferencias signicativas entre el segmento
no tratado (control) y el tratado (experimental) con AP7121.
La formación de biopelículas conduce a una pobre
penetración de los antimicrobianos e incrementa la farma-
corresistencia, raticando la necesidad de explorar nuevos
compuestos alternativos. En este estudio se demostró que
AP7121 fue ecaz en inhibición de la formación de biope-
lículas estalocócicas y tuvo efectos inhibitorios y bacteri-
cidas sobre células de biopelículas ya establecidas, lo que
demuestra que también fue capaz de atravesar biopelículas
existentes. La actividad de AP7121 sobre las bacterias sésiles
se facilita por su carácter hidrofóbico, y la producción de
muerte por lisis bacteriana formando poros en la membrana
(Sparo et al., 2006; 2009; Delpech et al., 2020).
Es importante destacar que en AP se ha demostrado la
ausencia de efectos citotóxicos (Sparo, 2006).
CONCLUSIONES
El péptido AP7121 podría constituir una potencial herramien-
ta para la inhibición de formación de biopelículas en CV. Los
resultados preliminares obtenidos in vitro indican una acción
rápida del péptido AP7121, sugiriendo que podría aplicarse
previamente o en el momento de la colocación de catéteres
vasculares y con posibilidad de aplicación sucesiva durante
el uso del dispositivo médico. Sin embargo, son necesarios
futuros estudios in vivo para validar su ecacia.
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