194 Volumen XXV, Número 2
Revista de Ciencias Biológicas y de la Salud
http://biotecnia.unison.mx Universidad de Sonora
ISSN: 1665-1456
194
*Autor para correspondencia: Belkis Peteira Delgado
Correo electrónico: bpeteira@gmail.edu.cu
Recibido: 28 de noviembre de 2022
Aceptado: 10 de abril de 2023
Caracterización morfo – cultural y variabilidad genética y molecular de
aislamientos de Trichoderma
Morpho-cultural characterization and genetic and molecular variability of Trichoderma isolates
Danay Ynfante-Martínez1, Benedicto Martínez-Coca1, Belkis Peteira-Delgado1*, Yusimy Reyes-Duque2, Katia Gil3,
June Simpson3, Alfredo Herrera-Estrella3
1 Grupo de Fitopatología, Dirección de Sanidad Vegetal, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria, Censa. Autopista
Nacional km 23½, AP 10, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba.
2 Dpto. Biología y Sanidad Vegetal, Universidad Agraria de La Habana «Fructuoso Rodríguez Pérez» (UNAH). San José de las
Lajas, Mayabeque, Cuba.
3 Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad, Langebio, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados,
Cinvestav, Instituto Politécnico Nacional, IPN. CP 36821, Irapuato, Guanajuato, México.
RESUMEN
El género Trichoderma, descrito por Persoon y Rifai, con base
en características morfo - siológicas, contaba con nueve
especies; aunque no se diferenciaban satisfactoriamente.
Las técnicas moleculares permitieron raticar e identicar
otras nuevas; actualmente, se notican 453 especies de
Trichoderma. La identicación polifásica se impone, debido a
las complejidades del género. El trabajo tuvo como objetivo
caracterizar aislados de Trichoderma tomando como base as-
pectos morfo-culturales y genéticos. Las descripciones mor-
fológicas se realizaron por observaciones microscópicas de
microcultivos, según Rifai, Gams y Bissett. La compatibilidad
vegetativa se evaluó macroscópicamente, y se determinó el
tipo de reacción (compatible o incompatible). La variabilidad
genética se analizó por RAPD; utilizando el método Jaccard
mediante el paquete estadístico FreeTree. Los aislados
presentaron características morfológicas similares, aunque
hubo diferencias en la coloración de las colonias y la morfo-
metría de las estructuras fúngicas. Fueron compatibles con
las especies T. viride, T. asperellum y T. atroviride, y entre ellos.
Los RAPD generaron 92 bandas reproducibles, 65 fueron
polimórcas (70,7 %). El agrupamiento por UPGMA mostró
variabilidad intraespecíca, formándose cuatro grupos. Para
T.13, T.17, T.75 y T.78 se detectaron bandas especícas, útiles
para el diseño de cebadores especícos para la autenticación,
protección y monitoreo en sistemas productivos.
Palabras clave: caracterización morfométrica, compatibili-
dad vegetativa, variabilidad genética.
ABSTRACT
The genus Trichoderma, described by Persoon and Rifai, on
the basis of morpho-physiological characteristics, had nine
species; however, they were not satisfactorily dierentiated.
The molecular techniques allowed to ratify and to identify
other new ones; at present, 453 Trichoderma species are re-
ported. The polyphasic identication is imposed, due to the
complexities of the genus. The objective of this work was to
characterize Trichoderma isolates based on morphological-
cultural and genetic aspects. Morphological descriptions
were made from microscopic observations of microcultures,
according to Rifai, Gams and Bissett. The vegetative compa-
tibility relationships were macroscopically evaluated, and
the type of reaction (compatible or incompatible) was deter-
mined. The genetic variability was analyzed by RAPD; using
the Jaccard method with the FreeTree statistical package.
The isolates presented similar morphological characteristics,
although there were dierences in the colonies coloration
and the fungal structures morphometry. They were com-
patible with T. viride, T. asperellum and T. atroviride species,
and each other. RAPD generated 92 reproducible bands, 65
were polymorphic (70.7 %). Clustering by UPGMA showed
intraspecic variability, forming four groups. For T.13, T.17,
T.75 and T.78 specic bands were detected, useful for the
specic primers design for authentication, protection and
monitoring in productive systems.
Keywords: morphometric characterization, vegetative com-
patibility, genetic variability.
INTRODUCCIÓN
La variabilidad intra e interespecíca en el género Trichoder-
ma diculta la identicación de las especies. Aún en la ac-
tualidad, esto provoca discrepancias entre autores, respecto
a diferentes taxas de los clados clasicados (Druzhinina y
Kubicek, 2005 6B; Martínez et al., 2015).
En las primeras caracterizaciones morfológicas y cultu-
rales de aislamientos del género Trichoderma se detectó poli-
morsmo. Este fue uno de los motivos para que se designaran
nueve especies agregadas (Rifai, 1969). La variabilidad entre
aislamientos de una misma especie se observó, además, en
aspectos, siológicos y bioquímicos (Gakegne, 2018) y mo-
leculares (Pandya et al., 2017). Esta, en algunos casos, motivó
que ciertos aislados se identicaran como especies diferen-
tes. En relación con esto, Lieckfeldt et al. (1999) demostraron
que la especie Trichoderma viride Pers. ex S. F. Gray estaba
constituida por dos tipos morfológicamente distintos (tipo I
y II) y distinguieron al tipo I como el “verdadero” T. viride (el
anamorfo de Hypocrea) y el tipo II como una nueva especie,
identicada molecularmente y nombrada como Trichoderma
DOI: 10.18633/biotecnia.v25i2.1890
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asperellum Samuels Lieckfeldt & Nirenberg (Samuels et al.
1999) y en 2010 la de Trichoderma asperelloides Samuels sp.
nov, como nuevas especies. Además, con la utilización de
estas técnicas se reubicaron cepas de Trichoderma harzianum
Rifai en especies como T. asperellum, Trichoderma atroviride
Bissett y Trichoderma longibrachiatum Rifai (Lieckfeldt et al.,
1999; Hermosa et al., 2000), y cepas de T. atroviride o T. viride
como T. asperellum (Watanabe et al., 2005). Consecuente-
mente, el taxa en Trichoderma incrementó de nueve, a más
de 100 (Druzhinina et al., 2006); 254 (Bissett et al., 2015) y
actualmente, se notican 453 especies (Index Fungorum,
2021).
La incompatibilidad o compatibilidad somática o vege-
tativa evidencia la existencia o no de variabilidad genética
entre aislados de una misma especie de hongo, ya que cepas
con cercanía genética entre ellas, muestran patrones simila-
res de compatibilidad y viceversa (Galdames, 2001).
La compatibilidad entre aislados de Trichoderma se
trató de demostrar sobre la base que las células vegetativas
posiblemente basado en la cantidad de núcleos que poseen
estas (Samuels et al., 1998), pueden formar heterocarión en-
tre varias especies por medio de la anastomosis hifal, fusión
de protoplastos o las transferencias nucleares (Barcellos et al.,
2011). Precisamente por esto, la compatibilidad vegetativa
permite evaluar las relaciones genéticas entre especies y/o
cepas, y es un marcador útil para mostrar diversidad o varia-
bilidad genética en diferentes especies de hongos (Ortuño et
al., 2013; Moo koh et al., 2018).
En la actualidad, los marcadores moleculares son am-
pliamente utilizados para el estudio de relaciones taxonó-
micas y diversidad genética en disímiles organismos, inclu-
yendo los hongos (El_Komy et al., 2015). Los RAPD (del inglés
Random Amplied Polymorphic DNA, Polimorsmo del ADN
Amplicado al Azar) son de gran utilidad en la detección de
polimorsmo intra e interespecíco en hongos, debido a que
la técnica produce perles especícos individuales de ADN
molde, mediante la amplicación de fragmentos aleatorios
que se distribuyen por todo el genoma (Khattak et al., 2018).
Esto ha permitido su utilización en el mapeo, como la gene-
ración de huellas genéticas (Hassan et al., 2019).
En la Micoteca del Centro Nacional de Sanidad Agrope-
cuaria (CENSA) se conservan aislados con elevadas poten-
cialidades como Agentes de Control Biológico, sin embargo,
entre los más promisorios se demostró la existencia de varia-
bilidad patogénica (Cruz-Triana et al., 2018; Gakegne, 2018;
Infante y Martínez, 2020; Duarte et al., 2021), que se destacan
por su acción biorreguladora sobre una amplia gama de
enfermedades en diversos cultivos de interés económico y
siológica (Infante et al., 2015). Por ello, el presente trabajo
tuvo como objetivo caracterizar aislados de Trichoderma
tomando como base aspectos morfo-culturales, su compati-
bilidad vegetativa y variabilidad molecular.
MATERIALES Y MÉTODOS
Procesamiento de muestras y aislamiento de Trichoderma
Para el análisis, las muestras vegetales, primeramente se lava-
ron cuidadosamente con abundante agua corriente; durante
una hora y secaron con papel de ltro Whatman No. 4. Segui-
damente, se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1 %
durante 30 s y posteriormente con alcohol al 70 % durante 1
min; entre cada desinfección y al nal las muestras se lavaron
con tres cambios de agua destilada estéril por tres minutos
cada uno y secaron en papel adsorbente estéril. A continua-
ción, las muestras se cortaron en fragmentos de 1 cm y se
mezclaron para homogenizar. Por último, se seleccionaron
segmentos al azar y sembraron en placas Petri de 90 mm de
diámetro que contenían medio Papa Dextrosa Agar (PDA +
antibiótico; cloranfenicol 0,1g L-1) e incubaron a 28 ± 2°C a
oscuridad. También, se realizó el montaje de los fragmentos
en cámara húmeda; la incubación se realizó a temperatura
ambiente.
Las evaluaciones se realizaron diarias hasta la aparición
de estructuras reproductivas, durante 24 - 48 h.
Para la identicación, se realizaron preparaciones
tomando fracciones de las estructuras fúngicas visibles (mi-
celio y/o esporas); las cuales se visualizaron al microscopio
óptico Zeiss (modelo Axiostar plus; fabricado en Alemania)
con aumento de 400x. Después se realizaron varias siembras
de la colonia obtenida como Trichoderma; hasta obtener un
cultivo puro.
Los aislamientos y cepas de Trichoderma objeto de estu-
dio tienen diferentes orígenes (Tabla 1).
Caracterización morfo - cultural de aislamientos de Tri-
choderma
La caracterización micromorfológica de los aislamientos
de Trichoderma (T.) (T.13, T.17, T.75, T.78 y T.90) se realizó
tomando como base los aspectos morfológicos señalados
en las claves taxonómicas referidas por Rifai (1969) y Gams y
Bissett (1998): dimensiones y forma de los conidióforos, áli-
Tabla 1. Procedencia de los aislamientos y cepas de Trichoderma.
Table 1. Geographic origin of Trichoderma isolates and strains.
Aislamientos de Trichoderma Origen geográco
T.13 Cuba1. Guantánamo
T.17 Cuba1. Pinar del Río
T.75 Cuba1. La Habana
T.78 Cuba1. Mayabeque
T.90 Cuba1. Cienfuegos
T. atroviride (IMI206040) Suecia2
T. asperellum (215D) Holanda2
T. harzianum (G108) Guatemala2
T. viride Holanda2
1Aislamientos cubanos de Trichoderma, conservados en el Laboratorio de
Micología Vegetal (LMV) del CENSA.
2Cepas de referencia conservadas en el cepario del Laboratorio Nacional
de Genómica para la Biodiversidad (Langebio), Centro de Investigación y
de Estudios Avanzados (Cinvestav) del Instituto Politécnico Nacional (IPN),
México.
1Cuban Trichoderma isolates, preserved in the Vegetable Mycology Labora-
tory (VML) of CENSA.
2Reference strains conserved in the strain collection of the National Labo-
ratory of Genomics for Biodiversity (Langebio), Center for Research and
Advanced Studies (Cinvestav) from the National Polytechnic Institute (IPN),
Mexico.
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des y conidios, y además la ornamentación de estos últimos;
mientras que para la caracterización cultural (macroscópica)
se tuvo en cuenta el color, forma y textura de las colonias.
Las colonias de Trichoderma se obtuvieron a partir de
suspensiones de esporas (10 µL de una suspensión con una
concentración de 107 conidios.mL-1), procedentes de culti-
vos puros y monospóricos de tres días de sembrados en el
medio de cultivo Agar Malta (AM) (BioCen). La suspensión se
depositó centralmente en placas Petri de 90 mm de diáme-
tro, que contenían medio AM (BioCen, pH 5,5), incubadas a
temperatura de 20±2°C y régimen de oscuridad constante.
Las evaluaciones [características de las colonias: color, forma
y textura] comenzaron a partir de las 24 h de la inoculación,
hasta las 72 h; se determinaron por observación visual, do-
cumentadas mediante fotografías tomadas con una cámara
digital marca Canon PowerShot ELPH 180 8x (20 MP) (Provee-
dor Costa Rica).
La caracterización micromorfológica de los aislamientos
se realizó mediante observaciones microscópicas de las
estructuras fúngicas desarrolladas en los microcultivos. Para
ello, sobre portaobjetos estériles se vertió asépticamente una
película na de medio de cultivo PDA (BioCen; esterilizado a
121°C, durante 15 min y pH ajustado a 5,5) sobre la cual se
sembró un fragmento pequeño de micelio de los aislamien-
tos individualmente, proveniente de la zona de crecimiento
activo en la periferia de las colonias, crecidas sobre PDA du-
rante tres días, a 28 ± 2°C y régimen de oscuridad constante.
Posteriormente, los portaobjetos sembrados se colocaron
en placas Petri de 22 mm de diámetro esterilizadas y se in-
cubaron a temperatura de 28 ± 2°C y régimen de oscuridad
constante. A las 24 - 48 h de la siembra se visualizaron y mi-
dieron las estructuras fúngicas (30 conidióforos, 30 álides y
30 conidios), en un microscopio óptico marca Zeiss (modelo
Axiostar plus; fabricado en Alemania) con aumento de 100x
y 400x. Las estructuras, se documentaron como evidencia
gráca con una cámara digital marca Canon PowerShot ELPH
180 8x (20 MP) (Proveedor Costa Rica).
Variabilidad genética de aislamientos de Trichoderma
Compatibilidad vegetativa (Cv)
Para realizar el ensayo, se utilizaron cultivos de los aislados de
Trichoderma del LMV del CENSA, y de las cepas de T. atroviride
(IMI206040), T. viride (TV1), T. asperellum (215D) y T. harzia-
num (G108), conservadas en el Laboratorio de Genómica
para la biodiversidad, Langebio (Guanajuato, México). Todos
los aislados y cepas crecieron durante cinco días en medio
PDA (Difco) e incubados a 28 ± 2°C y régimen de oscuridad
constante.
Para estimar las relaciones genéticas, se realizaron con-
frontaciones entre los aislamientos cubanos y entre estos y
las cepas de referencia de Trichoderma; (Tabla 1). Para ello, un
disco de micelio de seis mm de diámetro de cada aislado y
cepa de Trichoderma, se sembró frente a otro, a una distancia
de 70 mm centralmente, en placas Petri de 90 mm de diá-
metro contentivas de medio PDA (Difco). Posteriormente, las
placas se incubaron bajo oscuridad constante a 28 ± 2ºC y
evaluaron a las 72 h. Las evaluaciones de las interacciones se
realizaron macroscópicamente y la compatibilidad de los ais-
lamientos se determinó, según el tipo de reacción entre ellos:
1) Incompatible: Formación de una línea sin crecimiento
evidente en la zona de contacto entre las colonias, nor-
malmente coloreada o pigmentada; o cuando un aislado
sobrecrece al otro.
2) Compatible: no se observa formación de línea en la zona
de interacción después del contacto entre las colonias,
aparentando una sola colonia.
Se tomó evidencia gráca de las interacciones, con una
cámara digital marca Canon PowerShot ELPH 180 8x (20 MP)
(Proveedor Costa Rica).
Variabilidad molecular de aislamientos de Trichoderma
Método de extracción del ADN
Sobre celofán colocado en el centro de placas Petri (Ø = 90
mm), contentivas de medio de cultivo PDA (Difco), se sembró
centralmente un disco de cada aislamiento cubano (Tabla 1)
por placa. Las placas se incubaron por 72 h a una temperatura
de 28 ± 2°C y oscuridad constante. Posteriormente, el micelio
se colectó con una espátula al retirar el celofán de la placa y
se congeló a -20°C. Para la extracción del ADN total se usó el
protocolo DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, MBH, Germany). El
pellet se resuspendió en 40 - 60 μL solución amortiguadora
TE 0,5X, incluido en el juego de reactivos. La calidad del ADN
se vericó por electroforesis en geles de agarosa al 0,8 %, con
solución amortiguadora de corrida TAE 1X (Tris base 40 mM,
ácido acético 57,1 mL y EDTA 2 mM a pH 8), durante 45 min a
100V, teñido con bromuro de etidio (cinco mg.mL-1) y visua-
lizado en un fotodocumentador (Biorad Gel Doc XR). La con-
centración del ADN se determinó en un espectrofotómetro
(nanodrop ND 1000), a las longitudes de onda de 260 y 280
nm, tomándose como muestras con buena calidad aquellas
cuyos valores estuvieron entre 1,8 a 2 (Sambrook et al., 1989).
La suspensión de ADN se conservó a 4°C hasta su uso en la
técnica para detectar polimorsmo entre los aislados.
Análisis RAPD
En el ensayo se usaron los aislados cubanos de Trichoderma
(Tabla 1). Para la amplicación por PCR con cebadores arbi-
trarios, se utilizó una mezcla de reacción cuyo volumen nal
de 25 μL contenía: solución amortiguadora de PCR (Tris HCl
20 mM a pH 8,4, KCl 50 mM), MgCl2 2 mM, dNTP 0,2 mM, Taq
ADN polimerasa 1U (Invitrogen), 100 ng de ADN genómico
total y 0,2 μM de cada cebador: OPA02, OPA13, OPB07,
OPB09, OPB10, OPE14, OPG02, OPG10, OPH03, OPH19 y
OPJ20 (Firma Operon Technologies, Alameda).
Las amplicaciones se realizaron en un termociclador
API Thermal Cycler; Applied Biosystems, E.U. con el siguiente
programa: un ciclo de desnaturalización inicial a 94°C duran-
te cinco min, seguido de 45 ciclos de: 94°C durante un min
(desnaturalización), 30°C durante 40 s (alineamiento) y 72 °C
durante dos min (extensión); con un ciclo de extensión nal
a 72 °C, durante 10 min.
Los fragmentos amplicados se separaron por electrofo-
resis en geles de agarosa al 1,5 % en TAE 1X, a 100 V durante
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1,5 h. La visualización y el registro de los datos se realizaron
como se describió anteriormente.
Análisis de los datos
A partir de los datos se confeccionó una matriz binaria donde
se le dio el valor 1 a la presencia de la banda y 0 a la ausencia,
solo se tuvieron en cuenta las bandas bien denidas. Poste-
riormente, se calculó el índice de similitud de Jaccard, se rea-
lizó un análisis de conglomerados por el método de UPGMA
y un remuestreo tipo “bootstrap” de 10000, para estimar la
robustez del dendrograma original, utilizando el paquete de
software FreeTree (Hampl et al., 2001).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Caracterización morfo - cultural de aislamientos de Tri-
choderma
Los aislamientos de Trichoderma mostraron las siguientes
características generales: rápido crecimiento, circular uni-
forme, colonias inicialmente blanquecinas, que se tornan de
color verde o azulado a las 72 h; presencia de hifas hialinas
septadas, conidióforos hialinos en penachos compactados
en forma piramidal, álides alargadas y ensanchadas en el
centro, y conidios ovalados de paredes ligeramente rugosas
observadas con aumento de 1000X.
Estas características ubican los aislamientos fundamen-
talmente en la especie: T. viride, según aspectos descritos en
las claves propuestas por Rifai (1969) y Gams y Bissett (1998).
Las características morfológicas observadas en los aisla-
mientos coinciden con noticaciones realizadas por Samuels
et al. (1999) y El-Sobky et al. (2019) en cuanto a: presencia de
micelio hifal septado e hialino, conidióforo hialino, conidios
generalmente ovalados, unicelulares, pequeños, formando
racimos terminales, hialinos, de color verde al llegar a la
maduración. Así como con las noticadas por Lieckfeldt et al.
(1999), en cuanto a la ornamentación de los conidios.
No obstante, los aislamientos entre sí, presentaron dife-
rencias en la coloración de las colonias y la morfometría de
las estructuras; evidenciándose variabilidad (Tabla 2, Figura
1A y B).
Si solo se tuviera en cuenta la variabilidad observada en
los caracteres morfológicos y culturales (Tabla 2), los aisla-
mientos se ubicarían en distintas especies, según lo descrito
en la clave de Gams y Bissett (1998). Precisamente esto es
uno de los motivos de identicaciones erróneas de especies
(Druzhinina et al., 2006), depositadas en las bases de datos
(Druzhinina y Kubicek, 2005 6B; Samuels et al., 2010).
Por esta razón, es necesario usar una taxonomía polifási-
ca que aborde varios criterios de clasicación, que permitan
identicar con mayor precisión y conabilidad las especies
del género (Samuels et al., 1999; Lieckfeldt et al., 1999; El-
Sobky et al., 2019; Haouhach et al., 2020).
La variabilidad se observó, además, al nivel siológico,
donde algunos de estos aislados pudieron esporular a 35ºC,
T.13 y T.90 procedentes de la región oriental y central del país,
donde la mayor parte del año las temperaturas medias son
elevadas (Infante et al., 2015). También presentaron diferen-
cias en la excreción de enzimas hidrolíticas, T.75 tuvo los ma-
yores niveles de actividad quitinasa, mientras que T.13 y T.17
los mayores de glucanasa (González et al., 2012). Es posible
que la variabilidad detectada intraespecíca esté relacionada
con su proceso evolutivo, aspecto a seguir investigando.
Variabilidad genética de los aislamientos de Trichoderma
Compatibilidad vegetativa (Cv)
Entre las cepas de referencia (Tabla 1), tomadas como patro-
nes, se observaron reacciones de compatibilidad entre cepas
de la misma especie (Figura 2 A-E) e incompatibilidad entre
especies diferentes (Figura 3 A-C), excepto para la interacción
F, G y H (Figura 2), las cuales fueron compatibles, aun siendo
especies diferentes.
Tabla 2. Características culturales y morfológicas de los aislamientos de Trichoderma, observadas a las 72 h.
Table 2. Morphological and cultural characteristics of Trichoderma isolates, observed at 72 h.
Aislamientos
Parámetros
Culturales (Fig. 1A) Morfológicas (Fig.1B)
Colonia Conidióforos (µm) Fiálides (µm) Conidios (µm)
T. 13
Verde brillante más oscuro
después de las 72h.
Presenta anillos que se unican al
pasar el tiempo.
(69) 71,4-88,1 (89,5) × (1,9)
2,3-4,6.
(4,7) 7,5-13,5 (15,9) × 2,3-3,7
(l/a 3,4).
Redondeados y/o elipsoidales 4,8-5,6
(6,4) × 3,2-4 (4,48) (l/a 1,4).
T. 17
Color verde azulado, con
crecimiento uniforme, que llega
a verde claro olivo durante la
maduración de las esporas.
(40,1) 41-88,6 × 1,9-4,7
(5,1).
(5,6) 6,1-8,4 (9,8) × 2,3-3,3
(l/a 2,6).
Redondeados y/o elipsoidales 4,8-5,9
(6,4) × 3,2-4,8 (5,6) (l/a 1,3).
T. 75
Verde olivo oscuro, hasta la
maduración de sus esporas.
Presenta micelio aéreo
blanquecino.
(50,4) 101,2-140 (198,7) ×
(2,8) 3,3-5,6 (6,5).
5,1-10,3 (12,1) × 2,8-3,7 (l/a
2,5).
Redondeados y/o elipsoidales 4-5
(5,1) × 3,2-4,2 (l/a 1,24).
T. 78 Micelio aéreo de coloración
verde olivo amarillento.
(38,2) 40,1-79,3 × (1,9)
2,8-5,1.
(6,5) 8,9-9,3 (10,3) × (2,3) 2,8-
4,7 (l/a 2,4).
Redondeados y/o elipsoidales 3,2-4,8
× 2,4-3,8 (4) (l/a 1,4).
T. 90 Verde claro, micelio aéreo
abundante.
(38,7) 46,6-93,3 × 3,7-4,7
(5,6) µm (l/a 1,5).
(3,7) 4,7-6,1 × (1,9) 2,3-3,3
µm (l/a 2,3).
Redondeados y/o elipsoidales 4-6,4 ×
(3,2) 3,5-4,5 (5,6) µm (l/a 1,2).
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Figura 1. Caracteres morfo-culturales de los aislados de Trichoderma sp. A) Características culturales en medio AM (temperatura de 20°C y pH
5,5 a las 72 h). B) Características morfológicas (48 h).
Figure 1. Morpho-cultural characteristics of Trichoderma isolates. A) Cultural characteristics in MA culture medium (temperature of 20°C and
pH 5.5, at 72 h). B) Morphological characteristics (48 h).
Figura 2. Reacciones de compatibilidad vegetativa entre las cepas de referencia. A) T. atroviride IMI206040 -T. atroviride IMI206040, B) T. virens - T.
virens, C) T. asperellum 215D - T. asperellum 215D, D) T. harzianum 204 - T. harzianum 204, E) T. viride - T. viride, F) T. atroviride IMI206040 - T. aspe-
rellum 215D, G) T. asperellum 215D - T. viride, H) T. atroviride IMI206040 - T. viride. [1er hongo (izquierda) - 2do hongo (derecha)].
Figure 2. Vegetative compatibility reactions between reference strains. A) T. atroviride IMI206040 -T. atroviride IMI206040, B) T. virens - T. virens, C)
T. asperellum 215D - T. asperellum 215D, D) T. harzianum 204 - T. harzianum 204, E) T. viride - T. viride, F) T. atroviride IMI206040 - T. asperellum 215D,
G) T. asperellum 215D - T. viride, H) T. atroviride IMI206040 - T. viride. [1st fungus (left) – 2nd fungus (right)].
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Esto indica, que estas especies deben estar genética-
mente estrechamente relacionadas, pues la compatibilidad
se logra cuando los alelos de todos los loci son idénticos
(Galdames, 2001). Este aspecto se tomó como criterio en las
observaciones del ensayo para los enfrentamientos de las
cepas de referencia con los aislados cubanos.
En las pruebas de confrontación realizadas entre los cin-
co aislados de Trichoderma en estudio y las cepas de referen-
cia antes mencionadas, se observaron también reacciones de
compatibilidad e incompatibilidad.
Las confrontaciones entre los aislados en estudio y las
cepas de referencia T. harzianum (G108), mostraron una clara
reacción de incompatibilidad (Figura 4 A-E), determinada por
la presencia de una barrera de inhibición [cambio de colora-
ción en las colonias (excreción de metabolitos al medio, Fi-
gura 4 A) o inhibición del crecimiento de una de las colonias,
Figura 4 E].
Barcellos et al. (2011) noticaron que la reacción de in-
compatibilidad se rige por un loci het, que limita la formación
de heterocariones entre individuos genéticamente distintos.
Es decir, si la diferencia es en uno o más loci het, las células
que participan en la fusión son compartimentadas y se so-
meten a un proceso lítico que conduce a la muerte celular.
En estos casos los aislados son incompatibles; el fenómeno
se identica por la vacuolación, disolución de núcleos y ge-
neración de pigmentos, lo que se describió como barrera de
reacción (Galdames, 2001).
Por otra parte, en las interacciones de las cepas de T.
asperellum (215D), T. atroviride (IMI206040) y T. viride (TV1)
con los aislados en estudio se observaron reacciones de com-
patibilidad (Fig. 5 A-Ñ), al igual que entre los propios aislados
(Figura 6 A, B y C).
La compatibilidad observada entre estas especies
pudiera estar relacionada con la existencia de un complejo
entre T. viride - T. atroviride (ambas pertenecen a la sección
Trichoderma, según análisis por ITS) (Lübeck et al., 2000). Con-
secuentemente, la identicación de T. asperellum por técnicas
moleculares a partir de T. viride, justicó que T. atroviride y T.
asperellum poseen características fenotípicas y talla del frag-
mento ITS muy similares (Hermosa et al., 2000). Este aspecto
explica la compatibilidad existente entre los aislados de estas
especies. Es por ello que, algunos aislados de T. atroviride o T.
viride se reclasicaron como T. asperellum (Sánchez-García et
al., 2017).
En relación con esto, Stocco (2014) demostró que entre
las especies de la sección Trichoderma, que incluye a T. viride,
más de una especie puede compartir la misma secuencia de
SSU (gen de la pequeña subunidad 18S), lo que indica pocas
diferencias entre estas. No se conoce si esta región está co-
rrelacionada con la Cv, y que, a ello, se deban los resultados
obtenidos. Independientemente, la evaluación de la Cv tiene
importancia para la identicación de aislamientos (Galda-
mes, 2001).
Figura 3. Reacciones de incompatibilidad entre las cepas de referencia. A) T. asperellum 215D - T. harzianum G108, B) T.
atroviride IMI206040 - T. harzianum G108, C) T. viride - T. harzianum G108. [1er hongo (izquierda) - 2do hongo (derecha)].
Figure 3. Incompatibility reactions between the reference strains. A) T. asperellum 215D - T. harzianum G108, B) T. atroviri-
de IMI206040 - T. harzianum G108, C) T. viride - T. harzianum G108. [1st fungus (left) – 2nd fungus (right)].
Figura 4. Reacciones de incompatibilidad vegetativa entre los aislamientos de Trichoderma y las cepas de referencia. A) T.13 - T. harzianum (G108), B) T.17 - T.
harzianum (G108), C) T.75 - T. harzianum (G108), D) T.78 - T. harzianum (G108), E) T.90 - T. harzianum (G108). [1er hongo (izquierda)- 2do hongo (derecha)].
Figure 4. Vegetative incompatibility reactions between Trichoderma isolates and the reference strains. A) T.13 - T. harzianum (G108), B) T.17 - T. harzianum
(G108), C) T.75 - T. harzianum (G108), D) T.78 - T. harzianum (G108), E) T.90 - T. harzianum (G108). [1st fungus (left) – 2nd fungus (right)].
200 Volumen XXV, Número 2
Ynfante-Martínez et al: Biotecnia / XXV (1): 194-203 (2023)
200
Figura 5. Reacciones de compatibilidad vegetativa entre los aislamientos de Trichoderma y las cepas de referencia. A) T.13 - T. viride, B) T.17 - T. viride, C) T.75
- T. viride, D) T.78 - T. viride, E) T.90 - T. viride, F) T.13 - T. asperellum 215D, G) T.17 - T. asperellum 215D, H) T.75 - T. asperellum 215D, I) T.78 - T. asperellum 215D, J)
T.90 - T. asperellum 215D, K) T.13 - T. atroviride IMI206040, L) T.17 - T. atroviride IMI206040, M) T.75 - T. atroviride IMI206040, N) T.78 - T. atroviride IMI206040, Ñ)
T.90 - T. atroviride IMI206040. [1er hongo (izquierda) - 2do hongo (derecha)].
Figure 5. Vegetative compatibility reactions between Trichoderma isolates and the reference strains. A) T.13 - T. viride, B) T.17 - T. viride, C) T.75 - T. viride, D)
T.78 - T. viride, E) T.90 - T. viride, F) T.13 - T. asperellum 215D, G) T.17 - T. asperellum 215D, H) T.75 - T. asperellum 215D, I) T.78 - T. asperellum 215D, J) T.90 - T.
asperellum 215D, K) T.13 - T. atroviride IMI206040, L) T.17 - T. atroviride IMI206040, M) T.75 - T. atroviride IMI206040, N) T.78 - T. atroviride IMI206040, Ñ) T.90 - T.
atroviride IMI206040. [1st fungus (left) – 2nd fungus (right)].
Figura 6. Reacciones de compatibilidad vegetativa entre los aislamientos de Trichoderma. A) T.75 - T.78, B) T.17 - T.90, C) T.
78 - T. 13. [1er hongo (izquierda)- 2do hongo (derecha)].
Figure 6. Vegetative compatibility reactions between Trichoderma isolates. A) T.75 - T.78, B) T.17 - T.90, C) T. 78 - T. 13. [1st
fungus (left) - 2nd fungus (right)].
201
Volumen XXV, Número 2
Ynfante-Martínez et al: Caracterización morfo – cultural y variabilidad genética / XXV (1): 194-203 (2023)
201
Teniendo en cuenta la compatibilidad vegetativa que
mostraron los aislamientos en estudio con las cepas de re-
ferencia T. asperellum 215D, T. atroviride IMI206040 y T. viride,
se puede inferir, que estos tienen relación taxonómica con
cualquiera de las tres especies antes mencionadas.
Cook y Baker (1983) con el uso de esta técnica (Cv) con-
rmaron la identicación taxonómica de aislados de Tricho-
derma realizada previamente por ellos, a partir de aspectos
morfológicos. En relación con esto, Galdames (2001), opinó
que este tipo de bioensayo (“prueba de compatibilidad”)
puede ser considerado como un criterio de clasicación de
las especies del género Trichoderma, debido a la consistencia
de los resultados, al comparar el agrupamiento obtenido
entre 21 cepas de Trichoderma spp., por técnicas moleculares
(RAPD y AFLPs) y la Cv.
De forma general, esta prueba demuestra que cepas
de una misma especie del hongo comparten patrones si-
milares de compatibilidad, lo que se reduce entre especies
más alejadas. Por tal motivo, puede ser considerada como
una alternativa, simple y rápida para valorar la especie a que
pertenece un nuevo aislado, siempre y cuando se cuente con
cepas de diferentes especies correctamente identicadas
molecularmente.
Desde el punto de vista práctico, es importante, ya que
tiene implicación en la formulación de productos biológicos
cuyo ingrediente activo es este antagonista y donde se
utilicen consorcios de especies, debido a que algunos de
ellos pueden inhibir al otro, sobre todo debido a liberación
de compuestos no-volátiles (Lelay et al., 2007). Algunas
investigaciones aclaran que cuando se aplica un consorcio
de microorganismos de la misma especie (relación intraes-
pecíca) o de especies diferentes (relación interespecíca) se
podría obtener mayor inhibición de los patógenos, así como
proporcionarle benecios a la planta (Moo koh et al., 2018).
En este sentido, Gallegos-Morales et al. (2022), evidenciaron
compatibilidad in vitro entre T. asperellum, T. harzianum y
Trichoderma lignorum; y al realizar co-aplicaciones tuvieron
hasta el 86 % de rendimientos por planta, y disminución en
la incidencia (71 %) y severidad por Fusarium sp., (59 %) en el
cultivo de Chile (Capsicum annuum L.).
Variabilidad molecular de los aislamientos
Análisis RAPD
Los 11 marcadores generaron un patrón de amplicación
claro y reproducible para cada aislamiento, con un total de 92
bandas reproducibles. De estas, 65 fueron polimórcas, para
un 70,7 % de polimorsmo. Los iniciadores OPA-13, OPB-07,
OPB-09, OPH-19 y OPJ-20 tuvieron 70 o más porciento de
polimorsmo (Tabla 3), destacándose el OPH-19 con 100 %
de polimorsmo.
Los datos generados por los RAPD formaron cuatro
grupos, una evidencia más de la variabilidad intraespecíca
entre los aislados en estudio (Figura 7).
La variabilidad obtenida por RAPD entre los aislados
puede ser usada para la detección de estos. El iniciador OPE-
14 amplicó una banda en el aislado T.17 que lo diferencia
Figura 7. Agrupamiento de cinco aislados de Trichoderma basado en el
polimorsmo por RAPD por el método de Jaccard.
Figure 7. Clustering of ve Trichoderma isolates based on polymorphism
by RAPD by Jaccard’s method.
Método de Jaccard
Tabla 3. Total de bandas generadas a partir de los aislamientos cubanos de
Trichoderma con el uso de 11 iniciadores RAPD.
Table 3. Total of bands generated from the Cuban Trichoderma isolates
using eleven RAPD primers.
Iniciador No. Total
de bandas
No. de bandas Poli-
mórcas % de Polimorsmo
OPA13 4 3 75
OPB07 10 7 70
OPB09 10 7 70
OPB10 6 4 66,7
OPE14 11 6 54,5
OPG02 6 4 66,7
OPH03 8 5 62,5
OPH18 5 3 60
OPH19 10 10 100
OPG10 10 6 60
OPJ20 12 10 83,3
Total 92 65
de T.13, para T.75 con el iniciador OPH-03 se produjeron tres
bandas que lo diferencian de T.78, y OPH-19, produjo una
banda en T.17 que lo distingue del resto de los aislados (Figu-
ra 8). Diferencias que puntualizan dicha variabilidad. Desde
otro punto de vista, estos resultados tienen importancia para
el diseño de cebadores especícos, para su identicación,
aspecto primordial para la autenticación, protección, y mo-
nitoreo de estos en campo.
Resultados similares obtuvieron Chandulal et al. (2016),
quienes encontraron con cinco iniciadores RAPD variabilidad
intraespecíca entre diez aislados de Trichoderma sp., obteni-
dos de suelo rizosferico de tomate (Solanum lycopersicum L.).
También, Ranga et al. (2017) detectaron elevada variabilidad
intraespecíca en nueve aislados de Trichoderma, con el uso
de 15 iniciadores. Asimismo, coinciden con los obtenidos
por Hernández et al. (2013), quienes con el uso de cuatro
iniciadores RAPD evidenciaron variabilidad intraespecíca
en diez aislados de Trichoderma spp. También, Hewedy et
al. (2020) revelaron un elevado polimorsmo de 80 % de
las bandas reproducibles en las cepas con siete iniciadores
RAPD.
Por su parte, El_Komy et al. (2015), encontraron elevada
variabilidad intraespecíca en 30 aislados de T. asperellum,
202 Volumen XXV, Número 2
Ynfante-Martínez et al: Biotecnia / XXV (1): 194-203 (2023)
202
con ocho cebadores RAPD, aunque esto no se relacionó
con la actividad quitinasa y glucanasa de estas cepas. En sus
investigaciones Kumar y Sharma (2011) declaran que, la va-
riabilidad detectada con marcadores RAPD se relaciona con
otros marcadores, siológicos o patogénicos. Los resultados
del ensayo coinciden con los informado por estos autores,
aunque parcialmente con los de El_Komy et al. (2015), ya que
los aislados de Trichoderma cubanos, presentan marcada
variabilidad enzimática (González et al., 2012).
CONCLUSIÓN
Los resultados del presente estudio demuestran la variab-
ilidad entre los aislados de Trichoderma sobre la base de
caracteres morfológicos y culturales, así como genéticos,
demostrada por la compatibilidad vegetativa y marcadores
RAPD.
En general, estos resultados revisten gran importancia
para la identicación, autenticación, protección y monitoreo
de estos, en sistemas productivos. Para su uso como futuros
controladores biológicos donde la variabilidad entre estos,
sea la complementación, con vistas a la obtención de pro-
ductos con mayor alcance, para su implementación dentro
de un manejo integrado sustentable.
CONFLICTO DE INTERESES
Los autores declaran no tener ningún conicto de intereses.
AGRADECIMIENTOS
La investigación se logró gracias al apoyo de una beca SEP,
otorgada por México. Con ello, agradecemos al Dr. Alfredo
Herrera Estrella, y a la Dra. June Simpson por su apoyo en
la realización de estos estudios, a través de una estancia en
sus Laboratorios, en el Centro de Investigación y de Estudios
Avanzados del Instituto Politécnico Nacional (IPN). Igualmen-
te, agradecer a los técnicos Ing. Pedro Martínez y MSc. Katia
Gil.
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Figura 8. Electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % en TBE de la amplicación con cebadores RAPD. Línea 1: M (1000 pb DNA Ladder, Invitrogen, E.U.);
Líneas 2-6: Aislamientos de Trichoderma en estudio.
Figure 8. Electrophoresis on 1.5 % agarose gel in TBE of the amplication with RAPD primers. Lane 1: M (1000pb DNA Ladder, Invitrogen, E.U.); Lanes
2-6: Trichoderma isolates under study.
203
Volumen XXV, Número 2
Ynfante-Martínez et al: Caracterización morfo – cultural y variabilidad genética / XXV (1): 194-203 (2023)
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