Revista de Ciencias Biológicas y de la Salud http://biotecnia.unison.mx
ISSN: 1665-1456
1 Coordinación de Ciencia de los Alimentos del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. Carretera Gustavo Enrique Astiazarán Rosas No. 46. Colonia La Victoria. Hermosillo, Sonora. C.P. 83304. México.
2 Coordinación de Alimentos de Origen Vegetal del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. Carretera Gustavo Enrique Astiazarán Rosas No. 46. Colonia La Victoria. Hermosillo, Sonora. C.P. 83304. México.
3 Departamento de Agricultura y Ganadería de la Universidad de Sonora. Carretera 100 a Bahía de Kino km. 21.5, Hermosillo, Sonora, México.
Stages of the cryopreservation protocol and its effect on the viability and regeneration of grapevine zygotic embryos (Vitis vinifera L.)
La vid es uno de los principales cultivos del mundo y el Estado de Sonora es el mayor productor de México. Este cultivo está en constante peligro por diversos factores bióticos y abióticos, de ahí la importancia de su conserva- ción. La crioconservación es idónea para este cultivo, pero puede provocar alteraciones fisiológicas, moleculares y bioquímicas, afectando la viabilidad y la regeneración. Por lo anterior, en este trabajo se planteó analizar el efecto de las etapas del protocolo de crioconservación sobre la viabilidad y regeneración de embriones cigóticos de vid. La viabilidad del tejido (V) y la regeneración de plántulas (RP), mostraron que la solución 2 de vitrificación de plantas (PVS2) ejerce pro- tección a los embriones (V: 85 %, RP: 60 %), mientras que la exposición combinada a la solución PVS2 y nitrógeno líquido (NL) ocasionó diminución de la viabilidad y regeneración (V: 68 %; RP: 2 %). Un efecto más drástico se observó cuando el tejido fue expuesto a PVS2+NL y recalentamiento (RC) (V: 68
%; RP: 0 %). Sin embargo, la viabilidad y la regeneración se recuperó cuando el tejido se sometió a PVS2+NL+RC y solu- ción de descarga (SD) (V: 92 %; RP: 60 %). Se concluye que la utilización de la solución de descarga es fundamental para disminuir daños a los tejidos debido a las diferentes etapas de crioconservación.
The grapevine is one of the main crops in the world, and Sonora State is the largest producer in Mexico. This crop is in constant danger due to various biotic and abiotic factors, therefore the importance of its conservation. Cryopreserva- tion is ideal for this culture, but it can cause physiological, molecular, and biochemical alterations, affecting viability and regeneration. Hence, this work analyzed the effect of cryopreservation protocol stages on the viability and regene- ration of grapevine zygotic embryos. Tissue viability (V) and plantlets regeneration (RP) showed that plant vitrification solution 2 (PVS2) protects embryos (V: 85 %, PR: 60 %), while
Volumen XXV, Número 3
combined exposure to PVS2 solution and liquid nitrogen (LN) caused decreased viability and regeneration (V: 68 %; PR: 2 %). A more drastic effect was observed when the tissue was exposed to PVS2+LN and rewarming (RW) (V: 68 %; PR: 0 %). However, viability and regeneration were recovered when the tissue was subjected to PVS2+LN+RW and unloa- ding solution (US) (V: 92 %; RP: 60 %). It is concluded that the use of the unloading solution is essential to decrease tissue damage due to the different stages of cryopreservation.
La crioconservación es una técnica que permite conservar el germoplasma de tejidos y células en nitrógeno líquido (NL) a una temperatura de - 196 °C con el uso de osmo y crioprotectores (González-Arnao et al., 2014; Nausch y Buyel, 2021). Entre los crioprotectores se encuentra la solución 2 de vitrificación de plantas (PVS2), la cual está compuesta por: glicerol 30 % (p/v), etilen-glicol 15 % (p/v), dimetilsulfóxido (DMSO) 15 % (p/v) y sacarosa 0.4 M. La PVS2 ha sido descrita como una solución crioprotectora eficiente y es la solución de vitrificación más utilizada para la crioconservación de tejidos vegetales (Sakai et al., 1990; Normah et al., 2019). Los componentes de esta solución interactúan con las moléculas de agua mediante fuerzas dipolo y puentes de hidrógeno, para disminuir la cantidad de moléculas de agua libres y así evitar se forme cristales de hielo extra e intracelular (Nausch y Buyel, 2021). Sin embargo, no optimizar las condiciones durante las distintas etapas de la crioconservación puede inducir alteraciones bioquímicas, fisiológicas y moleculares (Kaity et al., 2008; Rahmah et al., 2015; Zakaria et al., 2020; Quijada-Rivera et al., 2023), influyendo en la viabilidad y regeneración de los tejidos. Esto, es aún controversial, ya que algunos trabajos reportan que la crioconservación es una técnica eficiente, mientras que otros mencionan lo contrario. En este sentido, Martínez-Montero et al. (2012) y Souza et al. (2016) establecieron un protocolo de crioconservación para puntas de brote de Ananas comosus L., que no afectó el ren-
*Autor para correspondencia: Marisela Rivera-Domínguez
dimiento en campo de las puntas de brote crio conservadas (Villalobos-Olivera et al., 2019). Bettoni et al. (2019) reporta- ron el 50 - 55 % de regeneración en puntas de brote criocon- servadas de Vitis. Ganino et al. (2012) reportó plasmólisis en puntas de brote del híbrido Kober 5 BB (Vitis berlandieri y Vitis riparia) debido a la vitrificación. Además, en yemas axilares de vid se encontró que la deshidratación provocó un aumen- to del malondialdehído y el recalentamiento causó varia- bilidad genética. Mas aún, la PVS2 y el glicerol provocaron obscurecimiento del tejido (Lazo-Javalera et al., 2015; 2016; 2017). García-Coronado et al. (2016) reportaron alteración en los niveles de expresión del ADN metiltransferasas por la vitrificación en embriones cigóticos de vid cv. Red Globe. De ahí la importancia de evaluar las alteraciones que puede pro- vocar cada etapa del protocolo de crioconservación. Debido a lo anterior, el objetivo de este trabajo es analizar el efecto sobre la viabilidad y regeneración del tejido en respuesta a las distintas etapas del proceso de crioconservación para la optimización del protocolo.
Los embriones cigóticos se extrajeron de semillas de uvas de la variedad Red Globe obtenidas de mercados de abastos de la ciudad de Hermosillo, Sonora, México. Las frutas seleccio- nadas fueron lavadas con agua destilada y con jabón (deter- gente en polvo), y luego enjugadas con agua destilada estéril tres veces. Posteriormente, se extrajeron las semillas de las bayas, y se realizó una prueba de viabilidad de semillas me- diante flotación en agua destilada, para separar las pseudo- semillas (semillas que flotan) de las semillas llenas (semillas que precipitan) (Ugbede y Hamadina, 2018). Las semillas que precipitaron se desinfectaron con etanol al 70 % (v/v) por 1 min, después con hipoclorito de sodio al 1.5 % durante 7 min, y finalmente se enjuagaron con agua destilada estéril tres veces. En caso de ser necesario, las semillas se coloca- ron dentro de medio Murashige & Skoog (MS) (Murashige y Skoog, 1962) hasta por 15 d, para el desarrollo y maduración del embrión. Después, las semillas se trataron con 1000 ppm de ácido giberélico por 24 h a 25 °C, con la excepción del tratamiento control. Al finalizar el tratamiento con ácido giberélico, las semillas fueron diseccionadas con la ayuda del bisturí y el estereoscopio dentro de la campana de flujo laminar (Horizontal Laminar Flow Cabinet, Esco Airstream®) bajo condiciones estériles (Daigger Scientific Inc.) para la ex- tracción de los embriones (1 a 3 mm de longitud), los cuales fueron colocados dentro de crio-viales de 2 mL para realizar los tratamientos del protocolo de la crioconservación.
La crioconservación se realizó de acuerdo a lo descrito por García-Coronado et al. (2016). Los embriones fueron expues- tos a PVS2 [30 % (p/v) glicerol, 15 % (p/v) etilenglicol y 15 % (p/v) de dimetilsulfóxido (DMSO)] al 50 % por 10 min a 25 °C y después fueron expuestos a PVS2 al 100 % por 10 min a 4
°C. Posteriormente, se sumergieron en NL (-196 °C) durante 30 min y después fueron recalentados en baño de María a 38
La viabilidad se determinó mediante la técnica de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) de acuerdo a García-Coronado et al. (2016) y De Souza Grzybowski et al. (2012). Los embriones se colocaron en TTC (1 %) dentro de cajas Petri durante 24 h a 30 °C en obscuridad, y posteriormente fueron observados bajo microscopio estereoscopio.
La regeneración de plántulas se realizó colocando los embriones (T1-T6) en medio de regeneración conteniendo macronutrientes, micronutrientes y vitaminas MS (Murashi- ge and Skoog, 1962) modificado y suplementado con 0.035 mg/L de ácido giberélico, 50 mg/L de mio-inositol, 50 mg/L de hidrolizado de caseína, 30 g/L de sacarosa, 8 g/L de agar, 3 g/L de carbón activado y 0.1 g/L de citrato de hierro (Tiznado Hernández et al., 2015) e incubados a 26 °C con un fotoperio- do de 16 h luz y 8 h de oscuridad durante15 d.
En la Figura 1 se muestra el esquema representativo de la evaluación de la viabilidad y regeneración de embriones cigóticos de vid expuestos a las distintas etapas del protoco- lo de crioconservación.
Se realizó un diseño completamente al azar, dónde cada tratamiento (T1-T6) constó de 5 réplicas con 5 embriones cigóticos en cada réplica para cada análisis (viabilidad y regeneración). Los datos obtenidos se evaluaron mediante un análisis de la varianza (ANOVA) para comprobar las dife- rencias entre las medias, con un nivel de significancia del 95
%. Las variables respuesta fueron el porcentaje de viabilidad del análisis con TTC y el porcentaje de plántulas regenera- das, de acuerdo a los diferentes tratamientos (T1-T6). En los casos que mostraron diferencias significativas se realizó la prueba de comparación de medias mediante el método de Tukey-Kramer. Todos los datos se analizaron con el paquete estadístico NCSS (Statistical Number System, Kaysville UTA, EUA; versión 2021, v21.0.2).
La viabilidad de los embriones cigóticos se vio afectada en algunos pasos del protocolo de crioconservación. En el análi- sis de viabilidad con cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) (Figura 2A), se muestra que en el control (T1), en el tratamiento con
Figura 1. Diagrama representativo de la evaluación de la viabilidad y regeneración de embriones cigóticos de vid sometidos a distintas etapas del protocolo de crioconservación. T1: control, T2: NL, T3: PVS2, T4: PVS2+NL, T5: PVS2+NL+RC y T6 : PVS 2+NL+RD+SD.
Figure 1. Representative diagram of the viability and regeneration assessment of grapevine zygotic embryos subjected to different
stages of the cryopreservation protocol. T1: control, T2: NL, T3: PVS2, T4: PVS2+NL, T5: PVS2+NL+RC and T6 : PVS 2+NL+RD+SD.
Figura 2. Viabilidad y regeneración in vitro de embriones expuestos a distintas etapas del protocolo de criconservación. (A) Embriones teñidos con TTC y (B) Plántulas regeneradas a partir de embriones, sometidos a distintas etapas del protocolo de crioconservación. T1: control, T2: NL, T3: PVS2, T4: PVS2+NL, T5: PVS2+NL+RC y T6 : PVS 2+NL+RD+SD.
Figure 2. Viability and in vitro regeneration of embryos exposed at different stages of the cryopreservation protocol. (A) Embryos stained with
TTC and (B) Seedlings regenerated from embryos, subjected to different stages of the cryopreservation protocol. T1: control, T2: NL, T3: PVS2, T4:PVS2+NL, T5: PVS2+NL+RC and T6 : PVS 2+NL+RD+SD.
PVS2 (T3) así como el tratamiento con PVS2+NL+RC+SD (T6) muestran un color rojo por la formación de formazán que indica tejidos viables. Este color es más brillante y uniforme en comparación con los tratamientos NL (T2), PVS2+NL (T4), PVS2+NL+RC (T5). Este comportamiento se vio reflejado en la capacidad de regeneración in vitro de los embriones de los tratamientos T1, T3 y T6 después de 15 d en medio de regeneración (Figura 2B). En la Figura 2 se muestra que los embriones que presentaron mayor intensidad del formazán pudieron regenerarse y aquellos con baja intensidad de la coloración fueron los que tuvieron menor porcentaje de regeneración (T2 y T5).
Figura 3. Porcentaje de embriones viables inmediatamente después de cada tratamiento de crioconservación. T1: control, T2: NL, T3: PVS2, T4: PVS2+NL, T5: PVS2+NL+RC y T6: PVS2+NL+RD+SD. Letras distintas muestran las diferencias significativas entre los tratamientos, p < 0.05.
Figure 3. Percentage of viable embryos immediately after each cryopreser- vation treatment. T1: control, T2: NL, T3: PVS2, T4: PVS2+NL, T5: PVS2+NL+RC and T6: PVS 2+NL+RD+SD. Different letters show significant differences bet- ween treatments, p < 0.05.
No se encontraron diferencias significativas en el por- centaje de viabilidad (Figura 3) en los embriones de los trata- mientos NL y PVS2+NL y PVS2+NL+RC, dónde el valor osciló alrededor del 68 %, siendo el porcentaje de viabilidad más bajo en comparación con el control (100 %) y los tratamien- tos con PVS2 y PVS2+NL+RC+SD. Los embriones expuestos solo a PVS2 mostraron un porcentaje de viabilidad de 84 %, mientras que los expuestos al tratamiento PVS2+NL+RC+SD mostraron un 92 % de viabilidad, sin diferencias significativas (p > 0.05) respecto al control (V: 100 %).
La regeneración de plántulas a partir de los embriones expuestos a las distintas etapas del protocolo (tratamientos) de crioconservación se puede observar en la Figura 4, dónde se muestra que el control mostró el crecimiento óptimo de plántulas (RP: 100 %), mientras que en el tratamiento con NL el crecimiento fue casi nulo (RP: 4 %), lo cual puede rela-
Figura 4. Porcentaje de plántulas regeneradas después 15 días en medio de regeneración. T1: control, T2: NL, T3: PVS2, T4: PVS2+NL, T5: PVS2+NL+RC y T6: PVS 2+NL+RD+SD. Letras diferentes muestran las diferencias significati- vas entre los tratamientos, p < 0.05.
Figure 4. Percentage of regenerated seedlings after 15 days in regeneration medium. T1: control, T2: NL, T3: PVS2, T4: PVS2+NL, T5: PVS2+NL+RC and T6:
PVS 2+NL+RD+SD. Different letters show significant differences between treatments, p < 0.05.
cionarse con la baja intensidad de formazán en el ensayo de viabilidad con TTC (Figura 2A). La regeneración de las plántu- las en el tratamiento dónde se expone el tejido solamente a PVS2 y en el tratamiento PVS2+NL+RC+SD fue similar (RP: 60
%), sin diferencias significativas respecto al control. En el tra- tamiento PVS2+NL, el porcentaje de regeneración disminuyó (RP: 52 %), sin embargo, no fue significativa con respecto al tratamiento PVS2 y al tratamiento PVS2+NL+RC+SD, pero si se encontró diferencia significativa respecto con el control. El crecimiento de las plántulas en el tratamiento PVS2+NL+RC fue nulo, similar al tratamiento con NL. Lo anterior indica que tanto la exposición a NL así como la combinación NL y RC afectan en gran medida el proceso de regeneración de los embriones en estas etapas del protocolo de crioconserva- ción, sin embargo la adición de la SD ayuda a recuperarse del posible daño producido por las etapas anteriores durante el proceso de crioconservación.
El análisis de viabilidad con TTC es implementado para evaluar la viabilidad de semillas (De Souza Grzybowski et al., 2012). Cuando el tejido es viable se desarrolla un compuesto llamado formazán, indicado por un color rojo brillante, de- bido a la reducción de sales de tetrazolio por la respiración celular en la mitocondria. En cambio, cuando el tejido no es viable no existe la formación de formazán (González-Vera et al., 2019). En este estudio, observamos que la viabilidad de los embriones al utilizar la PVS2 no se vio afectada, pero si por la exposición del tejido a NL y al recalentamiento (PVS2+NL+RC) (Figura 3A). Sin embargo, al utilizar la solución de descarga (PVS2+NL+RC+SD) la viabilidad fue recuperada. Cabe mencionar que los resultados que se obtienen de la
prueba de TTC no son totalmente indicativos de la viabilidad final del tejido, ya que las enzimas encargadas de metaboli- zar el formazán pueden aún estar activas en células muertas (Nausch y Buyel, 2021), no obstante, este análisis puede ser de gran utilidad como primer acercamiento para discernir entre tejidos con potencial de germinación y regeneración. La prueba de viabilidad más confiable es sin duda la rege- neración de los tejidos después del tratamiento (Pinto et al., 2016). Es importante destacar que la prueba de TTC se realizó inmediatamente después de cada uno de los tratamientos, en cambio, la regeneración de los embriones a plántulas se obtiene 15 d después de que el tejido es mantenido en cultivo de tejidos in vitro en medio de regeneración, por lo que en este periodo los embriones pudieron tener tiempo para poder recuperarse de alguna alteración debido a los tratamientos de crioconservación.
En el análisis de regeneración de plántulas (Figura 4) los resultados son similares a los que se obtuvieron con el análisis con TTC, donde la viabilidad no se vio afectada de manera significativa con el uso de PVS2, pero si cuando se expone el tejido a NL y al recalentamiento (PVS2+NL+RC). Esto último indica que la exposición a NL y el recalentamien- to pueden estar afectando al tejido de manera que generan estrés osmótico por los cambios de temperatura. Además, la viabilidad fue recuperada con el uso de la solución de descar- ga (PVS2+NL+RC+SD) debido a que los componentes de la solución de descarga ayudaron a disminuir el estrés osmótico que se ocasiona sobre el tejido posterior al recalentamiento (Kaczmarczyk et al., 2012; Da Silva Cordeiro et al., 2020), mejorando la regeneración del tejido. García-Coronado et al. (2016) y Lazo-Javalera et al. (2018) evaluaron la viabilidad de embriones cigóticos de vid cv. Red Globe crioconservados mediante la regeneración de plántulas reportando un 30 % y 50 % de regeneración respectivamente. En este estudio se logró obtener 60 % de regeneración al final del protocolo de crioconservación. Datos similares (50 - 55 %) fueron repor- tados por Bettoni et al. (2019) en puntas de brote de Vitis vinífera crioconservadas. Varios reportes han sido publicados respecto a la germinación y viabilidad en diferentes tejidos de Vitis vinifera incluyendo polen, embriones somáticos, pun- tas de brotes, yemas, embriones somáticos en suspensión y semillas empleando distintas técnicas de crioconservación (Bi et al., 2017). En ellos los porcentajes de viabilidad y ger- minación oscilan entre 7 y hasta el 100 % dependiendo del procedimiento de crioconservación y tipo de tejido (Bi et al., 2027). Cabe destacar que, aún no se ha descrito un protocolo de crioconservación óptimo para la conservación de embrio- nes cigóticos de vid. En trabajos previos hemos reportado la crioconservación de embriones cigóticos (García-Coronado, et al., 2016; Quijada-Rivera et al., 2022). En este sentido, el porcentaje de regeneración obtenido en este estudio fue me- jorado respecto a nuestros estudios previos. Este es el primer trabajo de Vitis donde se analiza cada una de las etapas del protocolo de la crioconservación, con la finalidad de identifi- car cuál de ellas puede estar ocasionado alguna alteración en los tejidos, que puedan afectar la viabilidad y regeneración
con el fin de optimizar la metodología de crioconservación por tiempo prolongado en embriones cigóticos de vid.
Las distintas etapas del protocolo de crioconservación afec- taron en grado distinto la viabilidad y la regeneración de los embriones cigóticos de vid, sin embargo, el uso de la solu- ción de descarga es fundamental para disminuir los daños posibles ocasionados a los tejidos debido a las diferentes etapas del protocolo de la crioconservación, mejorando y reestableciendo la regeneración de los tejidos.
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