Revista de Ciencias Biológicas y de la Salud http://biotecnia.unison.mx
Universidad de Sonora
ISSN: 1665-1456
Lourdes Fora Quispe1 , Diana Galeska Farfan Pajuelo1 , Milena Carpio Mamani1
1 Facultad de Ciencias, Escuela Profesional de Biología-Microbiología, Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann, Av. Cusco s/n, Tacna 23004, Perú.
Isolation and phylogenetic characterization of cultivable native bacteria from abandoned mines in Tacna, Peru
Las bacterias nativas adaptadas a ambientes contaminados han demostrado su gran capacidad de sobrevivir en condi- ciones adversas. El objetivo de este estudio fue identificar las bacterias presentes en suelos de minas abandonadas, ade- más de investigar las relaciones filogenéticas de estas bacte- rias nativas cultivables. Se realizó el aislamiento bacteriano, la extracción de ADN, amplificación por PCR, secuenciación del gen 16S ARNr, reconstrucción filogenética de Máxima Verosimilitud (ML) con RaXML, e identificación de géneros re- lacionadas con microreact. Las secuencias obtenidas fueron editadas a un tamaño de 1200 – 1400 pb, que posteriormente se compararon con 1137 secuencias procedentes de la base de datos del GenBank. Los nueve aislamientos obtenidos se agruparon filogenéticamente en seis grupos que corres- ponderían a los géneros Bacillus, Cytobacillus, Paenibacillus, Microbacterium, Peribacillus, Acinetobacter. Por lo tanto, se resalta el potencial inexplorado de estas bacterias para ser utilizadas en procesos de biorremediación. Además, algunas de estas bacterias pueden ser propuestos como indicadores de contaminación, lo que amerita realizar una investigación más detallada debido a que estos microorganismos pueden ser empleados en futuras investigaciones.
Native bacteria adapted to contaminated environments have demonstrated their remarkable survival ability under adverse conditions. This study aimed to identify bacteria present in soils from abandoned mines and to investigate the phylogenetic relationships of these cultivable native bacte- ria. Bacterial isolation, DNA extraction, PCR amplification, 16S rRNA gene sequencing, Maximum Likelihood phylogenetic reconstruction using RaXML, and identification of related genera using microreact, were conducted. The obtained sequences were edited to a 1200 – 1400 bp size, and subse- quently compared with 1137 sequences from the GenBank database. The nine obtained isolates were phylogenetically grouped into six clusters corresponding to the genera Bacil- lus, Cytobacillus, Paenibacillus, Microbacterium, Peribacillus,
Volumen XXVI
DOI: 10.18633/biotecnia.v26.2130
and Acinetobacter. Thus, the unexplored potential of these bacteria for use in bioremediation processes is highlighted. Additionally, some of these bacteria may be proposed as pol- lution indicators, warranting further detailed investigation as these microorganisms could be employed in future research endeavors.
Las minas abandonadas o inactivas son un problema a nivel global, que representan una amenaza potencial para la salud y el ambiente (Candeias et al., 2019). Durante los procesos extractivos, es común que se generen residuos mineros que permanecen en el suelo (Ali y Khan, 2017), estos desechos ex- hiben la capacidad de ser transportadores de contaminantes, pudiendo ingresar a la cadena alimentaria (Wuana y Okiei- men, 2011; Bini et al., 2017), este fenómeno puede ocasionar perturbaciones en el entorno del ecosistema.
A nivel mundial, se estima que existen más de un mi- llón de minas abandonadas, incluidos pozos, socavones y minas aluviales en funcionamiento (Coelho y Teixeira, 2011). Especificamente en las explotaciones de cobre, se realizan comunmente a tajo abierto, generando grandes cantida- des de desechos. La producción de una tonelada de cobre, requieren más de 150 toneladas de mineral, las cuales son sometidas a procesos de excavación, trituración, flotación y extracción mediante diferentes métodos que dependen de la naturaleza del material (Rzymski et al., 2017). La extrac- ción de azufre, está condicionada por la profundidad del yacimiento, resultando en un impacto ambiental perjudicial, típicamente manifestado como la acidificación del suelo (Tabak et al., 2020). De estos factores surge a la necesidad de recuperar los terrenos mineros abandonados, un desafío que en algunos casos resulta ser extraordinariamente compleja (Favas et al., 2018).
Desde esta perspectiva, se han desarrollado meto- dologías orientadas a mejorar y desarrollar una gestión eficiente de los desechos mineros (Agboola et al., 2020), con la finalidad de mitigar y atenuar el impacto generado en el ambiente. En este enfoque, los microorganismos son los más
*Autor para correspondencia: César Julio Cáceda Quiroz
Correo-e:ccacedaq@unjgb.edu.pe Recibido: 16 de agosto de2023 Aceptado: 10 de febrero de 2024
Publicado: 04 de marzo de 2024
utilizados para desintoxicar una gran cantidad de contami- nantes a través de su actividad metabólica (Liu et al., 2021; Bala et al., 2022).
Las bacterias presentes en el suelo desempeñan un rol importante en el mantenimiento de la dinámica ecológica (Fernandes et al., 2018). Además, se puede encontrar espe- cies bacterianas aún no caracterizadas, que habitan en sitios contaminados (Altimira et al., 2012; Salam y Varma, 2019), las cuales poseen la capacidad de convertir los desechos en valiosos recursos biológicos (Kumar y Gopal, 2015), resistir el estrés ambiental a través de la mutación y evolución, permitiéndoles sobrevivir en una amplia diversidad de áreas y condiciones ambientales (Jiang et al., 2020). Estos microorganismos autóctonos son un grupo de consorcios microbianos innatos que habitan en el suelo (Jan et al., 2020), y resultan altamente beneficiosos en aplicaciones de bioli- xiviación, biodegradación, biofertilizante, natural farming, y biocompostaje, generando beneficios económicos, sociales y de protección ambiental (Kumar y Gopal, 2015; Kapahi y Sachdeva, 2019; Verma y Kuila, 2019; Zhang et al., 2020). Su empleo puede aumentar la eficiencia en los procesos de biorremediación, debido a su gran potencial para sobrevivir en diversos ambientes y puede evitar impactos ecológicos impredecibles asociados con la introducción de organismos no nativos (Bôto et al., 2021). En este sentido, es necesario comprender la diversidad bacteriana en ambientes especí- ficos, debido que permiten comprender la complejidad de estos sistemas (Valenzuela-González et al., 2015).
El gen 16S rRNA se usa ampliamente en filogenia bacte- riana (Hassler et al., 2022), este análisis de secuencias facilita la identificación de cepas raramente aisladas, y puede con- ducir al reconocimiento de nuevos patógenos y bacterias no cultivables (Clarridge, 2004). Sin embargo, se ha demostrado que las plataformas de secuenciación de lectura corta, de las regiones variables del gen 16S rRNA no pueden lograr la resolución taxonómica que ofrece la secuenciación del gen completo (~ 1500 pb) (Johnson et al., 2019) a pesar de ser un método de identificación rápido y preciso para aislados bacterianos, no es aplicable para varios géneros y solo pro- porcionan identificación hasta el nivel de Género (Raina et al., 2019). Por otra parte, es importante entender las relaciones filogenéticas de las bacterias (Woese, 1987), debido a que genéticamente pueden estar relacionadas por similitudes en aspectos de funcionalidad. Los genomas bacterianos pueden contener rastros de una historia evolutiva compleja, que incluye una extensa recombinación homóloga, pérdida, duplicación y transferencia horizontal de genes (Zhou et al., 2020). Además, aún no se han estudiado a profundidad las bacterias que están asociados a suelos contaminados por metales pesados.
Por lo tanto, la presente investigación tuvo como obje- tivo identificar bacterias presentes en suelos contaminados en minas abandonadas, así como investigar sus relaciones filogenéticas de las bacterias nativas cultivables, con la posi- bilidad de emplearse en procesos de biorremediación.
El estudio se realizó en las minas abandonadas ubicadas en las provincias de Candarave (17° 3’ 1” LS y 70° 10’ 3.5” LW) y
Palca (17° 46’ 45.4” LS y 69° 51’ 57.0” LW) en el departamen- to Tacna, Perú. Estas instalaciones minereas realizaban la extracción de azufre y cobre respectivamente, y los pasivos ambientales que se analizo se encontró contaminación por arsénico, plomo y cianuro libre (Cáceda et al., 2022).
Para el aislamiento bacteriano se realizó un muestreo aleatorio compuesto en cinco puntos por cada área de inves- tigación, las muestras de residuos mineros se recolectaron a una profundidad de 0 - 15 cm, luego se almacenó y selló en bolsas de plástico de primer uso para luego ser transportadas al laboratorio de biorremediación de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann.
Para el aislamiento bacteriano, se pesó 100 g de cada muestra de residuo minero y se agregó en un matraz de un litro que contenía 200 mL de agua destilada estéril, posteriormente se homogenizó a 150 rpm a temperatura ambiente durante 1 h, luego se transfirió 10 mL del sobrenadante en 90 mL del medio Infusión Cerebro Corazón (ICC), que se incubó a 30 °C por 24 h (Restrepo et al., 2006; Kandasamy et al., 2015; Kha- mar et al., 2015). Finalmente, se sembró en placas con Agar Tripticasa Soya (ATS) y las bacterias fueron criopreservadas a - 80 °C en Caldo Tripticasa Soya (CTS) con 30 % de glicerol.
Se realizó la extracción de ADN utilizando el kit ADN bac- teriano innuPREP (AnalytikJena, 2017), posteriormente para la amplificación por PCR se utilizaron primers universales forward 27F 5’ AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3’ y reverse 1492R 5’ TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3’ (Hou et al., 2018); para la
reacción de PCR se utilizó con un volumen final de 25 µL, que incluye Buffer 10x (2.5 µL), 50 mM MgCl2 (1 µL), 2 mM, dNTP’s (2.5 µL), 10 nM primers (1 µL), 5U µL-1 Taq DNA polimerasa (0.20 µL) (Invitrogen), 8 ng de ADN que fueron cuantificados utilizando un fluorómetro Qubit 4 (Life Technologies, EE. UU.) y se completó con agua ultra pura, las condiciones de reacción fueron las siguientes: a 96 °C por 4 min, y 30 ciclos de 30 seg a 94 °C, 30 seg a 55 °C, y extensión de 1 min a 71 °C, con una extensión final de 10 min a 72 °C (Dos Santos et al., 2019). La cuantificación de ADN se realizó utilizando Qubit y se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1
%, los que contenían bandas visibles se enviaron a secuenciar a la empresa Macrogen, Seúl-Corea del Sur.
Las secuencias de ADN fueron alineadas y ensambladas mediante el software MEGA v6.0 y posteriormente la iden- tificación taxonómica se realizó comparándolo con la base de datos del GenBank, del Centro Nacional de Información Biotecnológica (National Center for Biotechnology Informa-
tion-NCBI), usando la herramienta BLASTN. Se consideraron sólo aquellas secuencias que presentaban un porcentaje de identidad superior a 94 % con la secuencia sometida. La reconstrucción filogenética de máxima verosimilitud (máxi- mum likelihood) se realizó mediante el programa RaXML y la identificación de géneros relacionados con el programa microreact.
En este estudio, todas las secuencias obtenidas fueron editadas a un tamaño de 1200 a 1400 pb. Posteriormente se realizó una búsqueda en la base del GenBank y se realizó la comparación de secuencias de nucleótidos mediante un Blast que reveló porcentajes de identidad superior al 94%. Para la reconstrucción filogenética de máxima verosimilitud se utilizó una metadata conformada por 1137 secuencias (Tabla 1, Figura 1) que incluyeron 116 géneros bacterianos.
Las cepas B1, B2, B4, B3, B5, B6, B9, B10, B11 fueron aislados de residuos mineros contaminados con arsénico, plomo y cinauro libre (Cáceda et al., 2022), estas bacterias se agruparon en 6 grupos que corresponde a los géneros Bacillus, Cytobacillus, Paenibacillus, Microbacterium, Periba- cillus y Acinetobacter (Figura 2), lo que indica su capacidad de sobrevivir, adaptarse y proliferarse en entornos adversos afectados por la contaminación, y podrían transformar los re- siduos en recursos biológicos valiosos (Kumar y Gopal, 2015), desempeñando un papel crucial en este tipo de hábitats, que podría aumentar la eficiencia en los procesos de biorreme- diación (Guo et al., 2010; Kumar y Gopal, 2015; Vaishnavi et al., 2019; Amrane et al., 2020).
El análisis filogenético obtenido mediante el método de máxima verosimilitud (ML), indica que la cepa B1 está estre-
Table 1. Identification of the strains
Tabla 1. Identificación de las cepas
Cepa | Identifiación | Cobertura (%) | Identidad (%) Accesion |
B1 | Paenibacillus | 100 | |
B2 | Bacillus | 100 | |
B3 | Cytobacillus | 100 | |
B4 | Peribacillus | 100 | |
B5 | Bacillus | 99 | |
B6 | Bacillus | 100 | |
B9 | Bacillus | 100 | |
B10 | Microbacterium | 100 | |
B11 | Acitenobacter | 99 |
Lista de géneros bacterianos identificadas a nivel molecular, mediante amplificación por PCR del gen ARN 16S, provenientes de muestras de suelos de minas abandonadas, en la provincia de Tacna, Perú.
chamente relacionada con el género Paenibacillus, la cepa B4 con Peribacillus, las cepas B2, B6, B9, B5 con el género Baci- llus, la cepa B3 esta relacionado con el género Cytobacillus, B10 con el género Microbacterium y la cepa B11 al género de Acitenobacter (Figura 3). Lo que sugiere que los taxones comparten características ecológicas y rasgos funcionales (Morrissey et al., 2016). El gen 16S ARNr comúnmente se utiliza para investigar la filogenia y la taxonomía bacteriana, proporcionando identificación a nivel de género y especie, la falta de una definición cuantitativa consensuada de género o especie dificulta la identificación a nivel de especie. En la ma- yoría de los casos, la identificación de géneros supera el 90% (Janda y Abbott, 2007), pero surgen dificultades debido a la similitud genética entre individuos que varía del 92% al 99% (Pereira et al., 2020), complicando la identificación precisa a nivel de especie (Clarridge, 2004).
Especificamente el género Bacillus alberga aproxima- damente 293 especies/subespecies, constituyen un grupo filogenéticamente incoherente (Patel y Gupta, 2020), además basado en el marco filogenético, la genómica comparativa y las características morfológicas, algunas especies se han separado del género Bacillus y se han asignado a nuevos gé- neros. Ademas, las relaciones entre individuos de una misma especie o género se actualizan periódicamente, proponiendo la transferencia de especies de estos clados a nuevos géneros de Bacillus como son: Alicyclobacillus, Paenibacillus, Aneurini- bacillus, Brevibacillus, Halobacillus, Virgibacillus, Filobacillus, Jeotgalibacillus y Peribacillus Cytobacillus, Mesobacillus, Neobacillus, Metabacillus y Alkalihalobacillus (Starostin et al., 2015; Jiang et al., 2021), que representan un paso importante hacia la clarificación de la filogenia y taxonomía del género Bacillus. Estos géneros tienden a formar clados en el árbol filogenético, algunos basados en secuencias concatenadas para grandes conjuntos de proteínas diferenciadas de otras especies de Bacillaceae (Patel y Gupta, 2020).
En el caso del género Bacillus, se han realizado investiga- ciones en biotecnología, considerándolos agentes potencial- mente activos y eficaces para la eliminación de diversos me- tales tóxicos presentes en el ambiente (Alotaibi et al., 2021; Arce-Inga et al., 2022). Las investigaciones realizadas por Zahoor y Rehman (2009), Guo et al. (2010), Gupta et al. (2010) así como Ayangbenro y Babalola (2020), aislaron Bacillus sp., Bacillus cereus, B. subtilis, B. thuringiensis, B. sterothermophilus,
B. megaterium, B. cereus, B. pumilus, B. licheniformis, B. jeotga- lim de ambientes contaminados demostrando tolerancia a metales pesados con capacidad para ser utilizados en proce- sos de biorremediación. Investigaciones realizadas por Ran et al. (2020) identificaron a Bacillus safensis de un suelo de mina contaminada por manganeso (Mn) y Mekuto et al. (2016) identificaron a Bacillus marisflavi, que tuvo la capacidad de crecer en medios que contienen CN- y SCN-.
Para Acinetbobacter sp., en investigaciones realizadas por Bazzi et al. (2020), Cai et al. (2021), Dhakephalkar y Chopade (1994), Irawati et al. (2021), Méndez et al. (2017), Nagvenkar y Ramaiah (2010), Pande et al. (2022) y Sevak et al. (2023) reportaron a Acinetobacter radioresistens, Acineto-
Figure 1. Phylogenetic reconstruction of maximum likelihood tree from 1137 sequences of the 16S rRNA gene. Figura 1. Reconstrucción filogenética de árbol de máxima verosimilitud a partir 1137 secuencias del gen ARNr 16S.
bacter calcoaceticus, A. baumannii, A. calcoaceticus, A. junii,
A. lwoffii y A. johnsonii, que fueron utilizados en procesos de biorremediación para extraer y detoxificar metales pesados transformando compuestos tóxicos como As, Cu, Cr, Hg, y Ag en sustancias menos tóxicas. Además, se ha demostrado la capacidad de este género para biodegradar hidrocarburos totales de petroleo, produciendo biosurfactantes en agua y suelo contaminando (Ortega et al., 2018). Acinetobacter venetianus ha demostrado la capacidad de degradar alcanos (Mahjoubi et al., 2013; Jung y Park, 2015; Nutman et al., 2016; Méndez et al., 2017; Ho et al., 2020; Cai et al., 2021).
Para el género Paenibacillus se han identificado a Pae- nibacillus polymyxa, Paenibacillus dendritiformis, Paenibacillus validus, Paenibacillus alba han mostrado potencial de eliminar metales pesados e hicrocarburos (Rawat y Rai, 2012; Çolak et al., 2013; Kim et al., 2015; Huang et al., 2019; Dawwam et al., 2023).
Además en investigaciones realizadas por Agarry et al. (2010), Onuoha (2014), Grady et al. (2016), Shibulal et al. (2017) y Sernaque et al. (2019), mencionaron que Paenibaci- llus spp. fué aislado de suelos contaminados.
En el caso del género Peribacillus, se han reportado 15 especies aisladas de muestras de suelo (Jiang et al., 2021). En el caso de Peribacillus frigoritolerans tiene la capacidad de degradar algunos plásticos (Wufuer et al., 2022).
Se conocen más de 90 especies de Microbacterium; en investigaciones realizadas por Corretto et al. (2020) aislaron 70 microbacterias, pertenecientes a 20 especies diferentes (entre ellas: M. azadirachtae, M. hydrocarbonoxydans, M. pumilum, M. oxydans, etc.) en suelos contaminados con zinc, plomo y cadmio; Sheng et al. (2008), Aniszewski et al. (2010) y Learman et al. (2019), aislaron 16 cepas diferentes de micro- bacterias de suelo presentes en suelo minero contaminado. Según Corretto et al. (2015) indican que varias especies de microbacterias han demostrado ser resistentes a diferentes metales pesados. Además, Salam et al. (2014) reportaron especies de este género que son capaces de tolerar y man- tenerse viables en suelos contaminados con hidrocarburos, altas concentraciones de metales pesados y con capacidad de degradar el antraceno. También Microbacterium terregenes está involucrado en la degradación del fenol (Abdel-Razek et al., 2015).
Figure 2. Maximum likelihood of phylogenetic reconstruction. A: Paenibacillus sp.; B: Bacillus sp.; C: Cytobacillus sp.; D: Peribacillus
sp.; F: Mycrobacterium sp. B10; G: Acitenobacter sp.
Figura 2. Reconstrucción filogenética de máxima verosimilitud. A: Paenibacillus sp.; B: Bacillus sp.; C: Cytobacillus sp.; D: Peribacil- lus sp.; F: Mycrobacterium sp. B10; G: Acitenobacter sp.
En relación al género de Cytobacillus, investigaciones realizadas por Tarasov et al. (2023) han reportado a Cytoba- cillus pseudoceanisediminis, Cytobacillus oceanisediminis y Cytobacillus firmus que resisten bien la acción de los com- puestos tóxicos de metales pesados y pueden ser utilizadas en tecnologías de biorremediación. Cytobacillus sp. ha sido aislado de suelos contaminados con petróleo crudo, mos- trando capacidad de remoción de metales como el niquel, cadmio y plomo (Hussein y Saeed 2022).
La capacidad de resistir a metales pesados en estos géneros se relaciona con la presencia de enzimas y genes de resistencia, que varían para cada microorganismo. La biotransformación bacteriana se considera esencial para una desintoxicación eficaz y para minimizar los riesgos tóxicos de los metales pesados en la seguridad ambiental, estas transformaciones incluyen la capacidad de Bacillus cereus MRS-1 para convertir Hg2+ en HgS, Bacillus pumilus S3 para transformar Pb2+ en PbS, Bacillus sp. KMO2 para convertir As3+ en As5+ y, Microbacterium sp. MRS-1 para la conversión
de Co2+ a Co O (Mathivanan et al., 2021).
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En consecuencia, la amenaza significativa originada por las actividades antropogénicas en el entorno ha impulsado la consideración de estrategias innovadoras de descon- taminación. Es crucial explorar las interacciones entre las comunidades microbianas en ambientes contaminados (Chandran et al., 2020). Por ende, es necesario profundizar en la investigación de estos géneros debido a sus posibles aplicaciones en los procesos de biorremediación. Además, se sugiere la utilización de diversos marcadores moleculares para una identificación precisa de los microorganismos, lo que permitirá comprender mejor las comunidades microbia- nas presentes en los suelo de minas abandonadas.
El aislamiento y la caracterización filogenética de bacterias nativas cultivables procedentes de minas abandonadas, per- mitió identificar nueve aislamientos que se agruparon filoge- néticamente en seis géneros distintos Bacillus, Cytobacillus, Paenibacillus, Microbacterium, Peribacillus y Acinetobacter. La complejidad de las comunidades bacterianas en suelos de minas abandonadas resalta la importancia de comprender estas interacciones microbianas en entornos contaminados y profundizar en la investigación de estos géneros debido a sus posibles aplicaciones en los procesos de biorremediación.
Agradecemos a la Universidad Nacional Jorge Basadre Groh- mann, por el financiamiento de este estudio, y a la Dirección Regional de Energía y Minas de Tacna por la orientación como guía de campo en la etapa inicial del proyecto.
Los autores declaran no tener ningún conflicto de interés.
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