Elementos genómicos asociados a la formación de

Artículo Original

biopelículas en Lactobacillus delbrueckii subespecie bulgaricus y

Lactobacillus delbrueckii subespecie lactis

Cesar Onoshi Sedano-Juaréz1

, Joivier Vichi-Lozada2

, Rodolfo Lagunes-Quintanilla3

, Raúl Dávila-

Delgado4 y América Ivette Barrera-Molina4*

1 Universidad Nacional Autónoma de México, Av. Universidad 3004, Copilco Universidad, Coyoacán, Ciudad de México.

2 Universidad Politécnica del Estado de Morelos, Cuauhnáhuac 566, Lomas del Texcal, 62574, Jiutepec Mor.

3 Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Salud Animal e Inocuidad (CENID-SAI).

4 Universidad Autónoma del Estado de Morelos, Facultad de Nutrición, Calle Ixtaccíhuatl 100, Vista Hermosa, 62350 Cuernavaca, Mor.

Genomic elements associated with biofilm formation in Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus and Lactobacillus delbrueckii subspecies lactis

ABSTRACT

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and L. delbrueckii subsp. lactis are two biotechnologically important subspe- cies within the group of lactic acid bacteria. Both are used to obtain products based on lactic fermentation and their activity as probiotics has been reported. The aim of the present study was to identify and compare the genomic ele- ments associated with biofilm formation in both subspecies using computational tools. The bibliometric analysis showed that adhesin genes, exopolysaccharide synthesis genes, and cis- and trans-regulatory elements could be associated with biofilm formation in both subspecies. The comparison of 12

L. delbrueckii subsp. bulgaricus and seven L. delbrueckii subsp. lactis genomes, detected the presence of the pili and srtA ge- nes in a conserved operon with identity percentages greater than 97 % between both subspecies. The inu gene that has a levansucrase function was also identified. Finally, the epsD gene was found present in a polycistronic transcriptional unit, encoding an enzyme associated with the synthesis of heteropolysaccharides. These data show, for the first time, evidence of the presence of genes that participate in biofilm formation in L. delbrueckii subsp. bulgaricus and L. delbrueckii subsp. lactis strains.

Keywords: pili gene; srtA gene; inu gene, epsD gene, bioin- formatic.

RESUMEN

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y L. delbrueckii subsp. lactis son dos subespecies biotecnológicamente importantes dentro del grupo de bacterias ácido-lácticas. Ambas se emplean en la obtención de productos basados en fermentación láctica y se ha reportado su actividad como probióticos. El objetivo del presente estudio fue identificar y comparar los elementos genómicos asociados a la formación de biopelículas en ambas subespecies utilizando herramien- tas computacionales. El análisis bibliométrico mostró que los genes de adhesinas, de síntesis de exopolisacáridos y ele-

*Autor para correspondencia: América Ivette Barrera-Molina Correo-e: america.barrera@uaem.mx

Recibido: 19 de agosto de 2024

Aceptado: 9 de octubre de 2024

Publicado: 27 de noviembre de 2024

mentos reguladores tipo cis y trans podrían estar asociados a la formación de biopelículas en ambas subespecies. La com- paración de 12 genomas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus y 7 de L. delbrueckii subsp. lactis detectaron la presencia de los genes pili y srtA en un operón conservado con porcentajes de identidad superiores al 97 %. También se identificó el gen inu que presenta función de levansucarasa. Finalmente se encontró el gen epsD, presente en una unidad transcripcio- nal policistrónica, que codifica para una enzima asociada a la síntesis de heteropolisacáridos. Estos datos muestran por primera vez, evidencia de la presencia de genes que partici- pan en la formación de biopelículas en cepas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus y de L. delbrueckii subsp. lactis.

Palabras clave: gen pili; gen srtA; gen inu, gen epsD, bioin- formática.

INTRODUCCIÓN

1

Lactobacillus delbrueckii, descrita inicialmente como Bacillus delbreuckii por Leichmann en 1896, corresponde a una espe- cie de bacterias grampositivas, productoras de ácido láctico. Desde su descubrimiento ha tenido una larga historia de aplicaciones en la microbiología y en la industria alimentaria, especialmente en la obtención de alimentos derivados de la fermentación láctica. En la actualidad, la especie com- prende seis subespecies: L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. delbrueckii subsp. lactis, L. delbrueckii subsp. delbrueckii, L. delbrueckii subsp. jakobsenii, L. delbrueckii subsp. sunkii y L. delbrueckii subsp. indicus. Estudios de genómica comparativa han demostrado que este grupo posee una alta diversidad intraespecífica, lo cual explica las diferencias en cuanto a los hábitats que ocupan y sus requerimientos nutricionales (Baek et al., 2023). Dentro del grupo de L. delbrueckii, las subespecies, bulgaricus y lactis son de mayor importancia co- mercial debido a su uso como cultivos iniciadores de varios alimentos derivados de lácteos, especialmente en la elabora- ción de queso y yogurt, junto con Streptococcus thermophilus (Rizzello y De Angelis, 2011), ya que mejoran la textura y el sabor de los productos.

Volumen XXVI

DOI: 10.18633/biotecnia.v26.2423

Revista de Ciencias Biológicas y de la Salud http://biotecnia.unison.mx

Universidad de Sonora

ISSN: 1665-1456

Adicionalmente, L. delbrueckii subsp. bulgaricus y L. delbrueckii subsp. lactis son microorganismos considerados GRAS (Generalmente Reconocidos como Seguros, por sus siglas en inglés), y presentan actividades probióticas con be- neficios demostrados para la salud. Estos beneficios incluyen la inhibición del crecimiento de bacterias patógenas en la mucosa intestinal (Oyeniran et al., 2020), efectos protectores en modelos de mucositis (De Jesus et al., 2019), inmunomo- dulación a nivel local y sistémico, y la mejora de parámetros bioquímicos de la sangre en estudios in vivo (Suzzi et al., 2020). El mecanismo probiótico de estas bacterias incluye la producción de ácido láctico, que reduce el pH del intestino e inhibe el crecimiento de patógenos, y la producción de bacteriocinas, que son sustancias antimicrobianas. Además contribuyen a la barrera intestinal y modulan el sistema inmunológico (El-Sayed et al., 2021). Sin embargo, para que estas bacterias proporcionen dichos beneficios, dependen en gran medida de la asimilación de determinadas fuentes de carbono, la producción de sustancias microbianas como las bacteriocinas y la capacidad de colonización de la mucosa intestinal, un proceso que está estrechamente relacionado con la formación de biopelículas (De Jesus et al., 2022).

Las biopelículas son comunidades microbianas estruc- turalmente organizadas, embebidas en una matriz compleja de exopolisacáridos (EPS), proteínas, ADN exógeno, y sustan- cias inorgánicas, que se adhieren a superficies sólidas o en interfaces superficiales (Sadekuzzaman et al., 2015).

Las especies bacterianas del género Lactobacillus son capaces de formar biopelículas una vez que alcanzan una densidad poblacional que permite la comunicación sincróni- ca entre ellas, un proceso conocido como “quorum sensing” (Lebeer et al., 2007). Cuando ocurre esta transición, se activa un sistema de comunicación mediante de señales químicas y se regula la expresión de genes específicos cuyos productos principales son los agentes que determinan la formación de las biopelículas (Ruiz et al., 2016). Sin embargo, es importante destacar que los reportes y estudios sobre la caracterización de los elementos genómicos asociados a la formación de las biopelículas en L. delbrueckii, son limitados. El propósito principal del este estudio es explorar las secuencias de ADN asociadas a la formación de las biopelículas en L. delbrueckii subsp. bulgaricus y L. delbrueckii subsp. lactis mediante herra- mientas de genómica comparativa. Este tipo de análisis per- mite inferir relaciones filogenéticas y comparar la existencia de elementos de regulación vinculados a secuencias de ADN entre diferentes cepas, así como la conservación de unidades transcripcionales relacionadas con la formación de estructu- ras y/o procesos celulares (de Crécy-Lagard et al., 2007).

MATERIALES Y MÉTODOS

Recuperación de secuencias genómicas y selección de genes asociados a formación de biopelículas

Los genomas bacterianos pertenecientes a cepas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus y L. delbrueckii subsp. lactis se recuperaron de la base de datos pública GenBank en formato

FASTA y GFF. Los genomas seleccionados estaban completa- mente secuenciados a la fecha de junio del 2021.

Para seleccionar genes que participan en la formación de biopelículas, se realizó una revisión exhaustiva de la literatura donde se caracterizaron genes y/o proteínas involucradas en las etapas de formación de biopelículas del género Lactoba- cillus. Una vez identificados los genes, se hizo la búsqueda de las secuencias codificantes en la base de datos pública GenBank y las secuencias se recuperaron en formato FASTA.

Análisis de identidad de las secuencias nucleotídicas y peptídicas

Una vez seleccionados los genes a estudiar, se buscaron en los genomas bacterianos de las cepas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus y L. delbrueckii subsp. lactis utilizando las herra- mientas bioinformáticas BLASTN y BLASTP. Las secuencias nucleotídicas y/o peptídicas identificadas de los genomas bacterianos se sometieron a un análisis de identidad me- diante un alineamiento local de secuencias nucleotídicas y/o peptídicas empleando los servidores BLASTN y BLASTP, con el objetivo de determinar el grado de conservación entre am- bas subespecies (Altschup et al., 1990). De los genes seleccio- nados se obtuvieron las secuencias peptídicas para analizar regiones o dominios proteicos de relevancia mediante los servidores UniProtKB de Expasy e Interpro.

Análisis de unidades transcripcionales y contexto genó- mico

Con la finalidad de identificar si los genes seleccionados se encuentran en unidades transcripcionales monocistrónicas o policistrónicas se empleó el programa Operon-mapper, el cual analiza la distancia intergénica de genes vecinos y las re- laciones funcionales de sus productos codificantes (Taboada et al., 2018). Por otro lado, el análisis del contexto genómico se realizó por medio del software Artemis (Rutherford et al., 2000). Subsecuentemente se utilizó el programa VISTA para la detección de diferencias en la presencia y orden de los genes que forman parte de las unidades transcripcionales (Frazer et al., 2004).

Detección de elementos reguladores

La identificación de potenciales factores de transcripción involucrados en la formación de las biopelículas, se realizó́ en dos etapas sucesivas: una búsqueda de reguladores transcripcionales descritos en la base de datos del NCBI tomando a Bacillus subtilis como microorganismo modelo, posteriormente, dichas secuencias fueron identificadas en los genomas de estudio pertenecientes a L. delbrueckii subsp. bulgaricus y L. delbrueckii subsp. lactis.

A continuación se recuperó la secuencia corriente arriba (400 pb) de los genes seleccionados utilizando el servidor RSAT: Prokaryotes (http://embnet.ccg.unam.mx/rsat/index. php) (Santana-Garcia et al., 2022). Con los programas Oligo- analysis y dyad-analysis (Defrance et al., 2008), se determinó si la secuencia corriente arriba identificada presenta motivos de unión a potenciales factores de transcripción en la forma- ción de las biopelículas.

RESULTADOS

Genomas bacterianos

El análisis de los genomas de referencia reportados en la base de datos Genbank mostró la anotación de 104 secuencias genómicas pertenecientes a 6 subespecies de L. delbrueckii, de las cuales sólo 27 genomas se encontraron secuenciados completamente. Las secuencias genómicas pertenecen a las cepas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus (11.5 %), L. delbruec- kii subsp. lactis (6.7 %) y cepas de otras subespecies (7.6 %). Siendo los genomas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus y de L. delbrueckii subsp. lactis los más representados de las cepas de L. delbrueckii.

Se recuperaron las secuencias genómicas completas en formato FASTA de L. delbrueckii subsp. bulgaricus (12 genomas) y de L. delbrueckii subsp. lactis (7 genomas) y se analizaron los datos reportados en la base de datos, de don- de se observa que el tamaño del genoma de las cepas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus es de aproximadamente 1.8 Mb, mientras que los genomas de L. delbrueckii subsp. lactis, se encuentran en un rango de 2.0 a 2.3 Mb. Ambas subespecies cuentan con un porcentaje de GC inferior al 50 % y un prome- dio de secuencias codificantes (CDS) de 1615. No obstante, cerca del 40 % de CDS presentan una función desconocida (Tabla 1).

Selección de genes asociados a la formación de biopelí- culas

Como primer paso para la elección de genes involucrados en la formación de biopelículas se hizo una revisión biblio- gráfica exhaustiva donde se analizaron genes y/o proteínas que participan en las etapas de formación de biopelículas de bacterias ácido-lácticas. De este análisis minucioso se seleccionaron diez genes bastante bien caracterizados, los genes: pili, welE, luxS, msa, ccpA, gadph, srtA, inu, bfrK y epsD (Leeber et al., 2012; Malik et al., 2013; Walter et al., 2008; Hao et al., 2011). Estos genes fueron buscados en los genomas de las cepas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus y de L. delbrueckii subsp. lactis. Los resultados muestran que existen genes aso- ciados al metabolismo de carbohidratos con mayor frecuen- cia en L. delbrueckii subsp. bulgaricus, mientras que genes asociados a la adhesión a superficie se identificaron de forma relevante en L. delbrueckii subsp. lactis (Figura 1). De los diez genes analizados, se seleccionaron 4 genes con evidencia experimental asociada a diferentes etapas de la formación de biopelículas en bacterias del género Lactobacillus; pili (pilina) y srtA (sortasa de clase A), son genes que codifican a enzimas involucradas en las etapas de adhesión primaria y secundaria; y los genes inu y epsD, los cuales participan en la etapa de maduración de las biopelículas produciendo homo y heteropolisacáridos (Tabla 2).

Tabla 1. Características generales de los genomas de las cepas de las subespecies de L. delbrueckii. El análisis de los genomas de cada cepa reveló que presen- tan un tamaño de aproximadamente 1.8 Mb, para L. delbrueckii subsp. bulgaricus, mientras que los genomas de L. delbrueckii subsp. lactis se encuentran en un rango de 2.0 a 2.3 Mb. En ambas subespecies se identificó un porcentaje de GC inferior al 50 % y un promedio de secuencias codificantes (CDS) de 1615. Table 1. General characteristics of the L. delbrueckii subspecies strains genomes. The analysis of each strain’s genomes revealed that they have a size of ap- proximately 1.8 Mb for L. delbrueckii subsp. bulgaricus, while the genomes of L. delbrueckii subsp. lactis range from 2.0 to 2.3 Mb. Both subspecies were found to have a GC content below 50% and an average of 1615 coding sequences (CDS).

Figura 1. Identificación de secuencias con similitud significativa con genes asociados a la formación de biopelículas en L. delbrueckii subsp. bulgaricus y L. delbrueckii subsp. lactis. Los genes pili, welE, msa, gadph y srtA son genes asociados a la adhesión celular, mien- tras que el gen luxS esta media el mecanismo del “quorum sensing”. El gen ccpA se ha descrito como un regulador del crecimiento bacteriano, y el gen bfrK participa en un complejo de regulación de dos componentes. Finalmente, los genes inu y epsD participan en la síntesis de polisacáridos.

Figure 1. Identification of sequences with significant similarity to genes associated with biofilm formation in L. delbrueckii subsp. bulgaricus and L. delbrueckii subsp. lactis. The pili, welE, msa, gadph, and srtA genes are associated with cell adhesion, while the luxS gene mediates the “quorum sensing” mechanism. The ccpA gene has been described as a regulator of bacterial growth, and the bfrK gene is involved in a two-component regulatory system. Finally, the inu and epsD genes are involved in polysaccharide synthesis.

149

152

111

103

98

86

80

68

61

42

37

30

27

27

17

12

14

12

4

1

160

140

120

Número de Hits reportados

100

80

60

40

20

0

pili welE msa gadph srtA luxS ccpA bfrK inu epsD

L. delbrueckii subsp. bulgaricus L. delbrueckii subsp. lactis

Tabla 2. Genes seleccionados involucrados en la formación de biopelículas. Los genes pili, srtA, inu y epsD fueron seleccionados para una caracterización bioinformática en los genomas de las cepas de L. delbrueckii subsp. bulgari- cus y L. delbrueckii subsp. lactis.

Table 2. Selected genes involved in biofilm formation. The pili, srtA, inu, and epsD genes were selected for a bioinformatic characterization in the genomes of L. delbrueckii subsp. bulgaricus and L. delbrueckii subsp. lactis strains.

Caracterización bioinformática de los genes asociados a la formación de biopelículas

La caracterización de los genes asociados a la formación de biopelículas se realizó a parir de los archivos en formato GFF. La búsqueda inicial del gen pili en los genomas de L. del- brueckii subsp. lactis y L. delbrueckii subsp. bulgaricus indicó que corresponde a una secuencia anotada como Prepilin- type N-terminal con una extensión de 324 nucleótidos. El alineamiento local de la secuencia de nucleótidos mostró que el gen de Prepilin-type N-terminal se encuentra presente en el 100 % de los genomas de estudio, L. delbrueckii subsp. bulgaricus (12) y L. delbrueckii subsp. lactis (7). Se identificó un porcentaje de identidad global en un rango del 97.2 % al

98.77 % para L. delbrueckii subsp. bulgaricus y del 98.46 % al 100 % para L. delbrueckii subsp. lactis (Tabla 3). Con respecto al gen srtA presenta una extensión de aproximadamente 702 nucleótidos y una localización muy variable según entre las subespecies y las diferentes cepas, está presente en el 100

% de los genomas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus (12) y

L. delbrueckii subsp. lactis (7), y el alineamiento nucleotídico reveló un rango de identidad del 98.15 % al 99.98 % para L. delbrueckii subsp. bulgaricus y de entre 99.15 % y 100 % para

L. delbrueckii subsp. lactis. (Tabla 3).

La etapa de maduración de las biopelículas consta de la síntesis de exopolisacáridos, que se pueden clasificar en ho- mopolisacáridos y heteropolisacáridos. El gen epsD participa en la síntesis de heteropolisacáridos durante la formación de la biopelícula, la secuencia genética de aproximadamente 777 pb fue determinada en el 100 % (12/12) de los genomas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus, con un porcentaje de iden- tidad superior de 96.78 %. Por otro lado, dicha secuencia fue identificada en el 71.4 % (5/7) de los genomas de la subes- pecie L. delbrueckii subsp. lactis. No se obtuvieron resultados positivos para las cepas KCCM 34717 y KCTC 3034 (Tabla 3).

Partiendo de la secuencia codificante de la inulosacarasa (inu) de Lactobacillus reuteri TMW1.106 se realizó un análisis de identidad para identificar proteínas homólogas en los genomas de estudio, teniendo como resultado la detección de cuatro proteínas: dos glicosil hidrolasas de la familia 68, una levansacarasa y una proteína hipotética LDE04_11610 con porcentajes de identidad del 43.83, 43.48, 43.83 y 45.15

% respectivamente (Tabla 4).

Análisis de familias y dominios funcionales

El análisis de familias y dominios proteicos realizado en Inter- pro mostró que la secuencia de aminoácidos del Prepilin-type

Tabla 3. Alineamiento de la secuencia nucleotídica de los genes pili, srtA y epsD. Para el alineamiento se utilizaron los genes de 1L. delbrueckii subsp. lactis KCCM 34717 y a 2L. del- brueckii subsp. bulgaricus 2038 como genes de referencias. N.D., no determinado.

Table 3. Nucleotide sequence alignment of the pili, srtA, and epsD genes. The genes from 1L. delbrueckii subsp. lactis KCCM 34717 and 2L. delbrueckii subsp. bulgaricus 2038 were used as reference genes for the alignment. N.D., not determined.

Tabla 4. Determinación de secuencias similares al gen inu de Lactobacillus reuteri TMW1.106 mediante análisis BLASTX. Se identificaron 4 secuencias con similitud al gen inu en genomas de algunas cepas de Lactobacillus delbrueckii, cuya función está relacionada con la síntesis de carbohidratos.

Table 4. Determination of sequences similar to the inu gene of Lactobacillus reuteri TMW1.106 through BLASTX analysis. Four sequences similar to the inu gene were identified in the genomes of some Lactobacillus delbrueckii strains, whose function is related to carbohydrate synthesis.

N-terminal pertenece a la familia de la proteína de compe- tencia “ComGC”, la cual representa una pseudopilina, a su vez conserva diferentes elementos, como el sitio de metilación procariota N-terminal, el dominio de escisión N- terminal y el motivo de metilación procariota N-terminal. El alineamiento de la secuencia peptídica determinó un porcentaje de iden- tidad superior al 98.14 %. Las cepas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus LJJ y ND04 presentaban hasta tres variaciones de nucleótidos, mientras que el resto únicamente presentaban dos modificaciones. Se analizó tambien si existían cambios puntales de aminoácidos entre las secuencias peptídicas. Las modificaciones de aminoácidos detectadas se encuentran en sitios de unión entre dominios. El residuo nueve es quien presenta cambios más frecuentes, cambiando una glutamina

(Q) por una prolina (P); pero también se encontraron cambios en la posición 21 entre una valina (V) y una leucina (L).

Por su parte, la proteína sortasa de clase A, pertenece a la familia sortasa, se caracteriza por anclar un gran número de proteínas de superficie funcionalmente distintas que con- tienen una señal de clasificación de pared celular bacteriana. La secuencia peptídica muestra un porcentaje de identidad superior del 99.57 %. Adicionalmente, se identificaron cam- bios de aminoácidos entre ambas subespecies, los cuales se presentan en los sitios de unión entre dominios. Los cambios observados en esta secuencia de aminoácidos no se presen- tan en el sitio activo ni en el sitio catalítico, se dan en sitios de unión entre dominios. Los cambios más significativos son entre una Asparagina (N) y un Aspartato (D) en la posición 204, mientras que la segunda variación con mayor incidencia fue en la posición 148, entre una Alanina (A) y una Glicina (G). En relación con las enzimas vinculadas a la síntesis de exopolisacáridos, la secuencia codificante del gen epsD pro- duce una proteína de 259 aminoácidos que forma parte de la familia de proteínas de síntesis de polisacáridos capsulares CpsB/CapC y contiene un dominio similar a PHP (polimerasa e histidiol fosfatasa). La secuencia peptídica de la proteína

mostró un porcentaje de identidad superior del 98.45 %.

Análisis del contexto genómico

El análisis de identificación de operones asociados a la adhe- rencia a superficies en L. delbrueckii subsp. bulgaricus 2038

realizado mediante el programa computacional Operon- mapper, permitió determinar que el gen correspondiente a la Pre-pilina tipo N-terminal se localizaba en un operón conformado por seis secuencias codificantes con las coorde- nadas genómicas 567122-570612. La unidad genética trans- cripcional comprende los genes: comGC, comGD, comGF, un regulador transcripcional, entre otras proteínas relacionadas a la síntesis de proteínas de membrana y adquisición de ADN exógeno.

Así mismo, se identificó que el gen srtA correspon- diente a la sortasa de clase A se encontraba inmerso en un operón constituido por ocho genes localizado en la posición 1166395-1176625. Dicho operón está constituido por 8 genes, presentando un tamaño aproximado de 10.5 Kb. La unidad genética transcripcional se encuentra con- formado por los genes: dnaK, dnaJ, grpE, hrcA, un regulador transcripcional, un gen codificante para una exonucleasa y una proteína de integración. Este hallazgo denota que los 8 genes que componen la unidad genética transcripcional podrían estar estructuralmente conservados, al menos entre los microorganismos L. delbrueckii subsp. lactis KCCM 34717 y L. delbrueckii subsp. bulgaricus 2038.

La síntesis de heteropolisacáridos se caracteriza por la participación de varios genes. El análisis del contexto genó- mico mostró que el gen epsD se encontraba en un operón asociado a la síntesis de exopolisacáridos. El operón tiene una extensión aproximada de 10.5 Kb y se compone por los genes: epsA, epsB, epsC, epsD, epsF, epsG, epsJ, epsK, epsM, entre otros. La mayoría de estos genes codifican para gluco- siltransferasas y galactosiltransferasas, enzimas que catalizan la transferencia de azúcares para la síntesis de polisacáridos. El mismo análisis en L. delbrueckii subsp. lactis DSM 20072 re- veló que se encuentra en un operón compuesto únicamente por 5 genes que codifican para proteínas relacionadas a la síntesis de exopolisacáridos y comprenden una extensión aproximada de 4.4 Kb, 6 Kb menos que en L. delbrueckii subsp. bulgaricus 2038. Así mismo, existe la presencia de proteínas hipotéticas, es decir enzimas con función descono- cida. Es importante destacar que, ningún gen se encuentra anotado como “Eps” por lo que se infiere que la unidad gené- tica transcripcional para la síntesis de exopolisacáridos está

presente pero no se encuentra caracterizada en los genomas estudiados.

Elementos reguladores asociados a la formación de las biopelículas

La búsqueda de factores de transcripción identificó un regulador transcripcional maestro asociado a la formación de biopelículas codificado por el gen sinR estudiado en Ba- cillus subtilis. Esta secuencia reguladora fue potencialmente identificada en el microorganismo Lactobacillus delbrueckii mediante un alineamiento local de secuencias peptídicas. El análisis indicó la presencia de una proteína llamada Helix- turn-helix Domain-containing con una cobertura de exten- sión de 45 % y un E-value de 2x10-9.

‌Finalmente, la búsqueda de proteínas relacionadas a fac- tores de transcripción con dominio Helix-turn-helix mostró la presencia de tres potenciales elementos reguladores en el 100 % de los genomas estudiados. Para el caso del regulador transcripcional, con el número de acceso WP_099279028.1 ubicado con las coordenadas genómicas 1665100-1665459 en L. delbrueckii subsp. bulgaricus 2038, se encontró que está anotado como una proteína hipotética conservada, además tiene secuencias genéticas adyacentes que codifican para proteínas hipotéticas y proteínas de biosíntesis de exopolisa- cáridos, entre ellas glucosiltransferasas.

Sitios de unión de factores de transcripción

‌Con el objetivo de identificar elementos de regulación en cis, se llevó a cabo un análisis de identificación de secuencias de unión a factores de transcripción mediante el software Oligo- analysis. Los resultados muestran una lista de motivos de unión ordenados significativamente. En la región río arriba (400 pb) de los operones que contienen los genes Prepilin-N- terminal, srtA y epsD, se identificaron ocho oligonucleótidos significativamente sobrerrepresentados (Figura 2).‌‌

El oligonucleótido de mayor rango, GCTGGA, se en- cuentra siete veces a lo largo de la secuencia región corriente arriba, mientras que se esperarían 0.47 ocurrencias por ca- sualidad. El P-value (occ_p = 6.2 x 10-7) indica la probabilidad

‌de observar al menos 7 ocurrencias cuando se esperan 0.47. El número esperado correspondiente de falsos positivos es bajo (occ_E = 1.3 x 10-3), lo que indica que es poco probable que la sobrerrepresentación sea resultado del azar. La sección correspondiente al Pattern asembly del ensamble número uno muestra que los hexanucleótidos GCTGGA y CCAGCG se pueden ensamblar para formar un solo motivo: CGCTGGA (Figura 2).

DISCUSIÓN

Ante el crecimiento exponencial de datos disponibles de múltiples proyectos de secuenciación de genomas procario- tas, la atención se ha centrado en comparaciones intraespe- cíficas que permitan descubrir genes asociados a procesos celulares específicos. Los análisis de secuencias intraespecí- ficas han demostrado ser fundamentales en la mejora de las anotaciones existentes, la identificación de nuevas regiones de codificación y la predicción de elementos reguladores (Windsor y Mitchell-Olds, 2006).

Los resultados del análisis bibliométrico mostraron que cuatro genes son fundamentales en las etapas de adhesión y maduración de las biopelículas (Tabla 2). Los genes seleccio- nados fueron el codificante a la subunidad monomérica de la pilina, proteína involucrada en la adhesión de las células bacterianas a una superficie sólida y responsables de la agre- gación celular para la formación de microcolonias (Lebeer et al., 2012; Oxaran et al., 2012). El gen srtA que se traduce en una proteína denominada sortasa de clase A, responsable de anclar covalentemente las proteínas de superficie a la pared celular (Malik et al., 2013). El gen inu, implicado en la produc- ción de glucanas y fructanas en el proceso de síntesis de ho- mopolisacáridos (Lebeer et al., 2009) y el gen epsD que forma parte de una unidad transcripcional policistrónica asociada a la síntesis de heteropolisacáridos (Lamothe et al., 2002). En la figura 3 se observa la posible activación de genes específicos que controlan el desarrollo y progreso de la biopelícula.

Las proteínas de adhesión en el género Lactobacillus son fundamentales para la adherencia eficiente a las células epiteliales intestinales y dar lugar a la agregación celular y

Figura 2. Logotipos de los motivos de unión a factores de transcripción identificados mediante el software Oligo-analysis. El análisis de la región río arriba (400 pb) de los operones que contienen los genes pili, srtA y epsD, reveló ocho oligonucleótidos significativamente sobrerrepresentados, de los cuales el hexanucleótido GCTGGA es el más representado. La evaluación con la herramienta bioinformá- tica Pattern asembly mostró que los hexanucleótidos GCTGGA y CCAGCG se pueden ensamblar para formar un solo motivo CGCTGGA. Figure 2. Logos of transcription factor binding motifs identified using Oligo-analysis software. Analysis of the upstream region (400 bp) of the operons containing the pili, srtA, and epsD genes revealed eight significantly overrepresented oligonucleotides, among which the hexanucleotide GCTGGA is the most represented. Evaluation with the bioinformatics tool Pattern Assembly, showed that the hex- anucleotides GCTGGA and CCAGCG can be assembled to form a single motif, CGCTGGA.

Figure 3. Modelo hipotético de activación de genes específicos que contro- lan el desarrollo y progreso de la biopelícula. Las bacterias libres (planctóni- cas) se acercan y se adhieren de manera reversible a una superficie. En segui- da, comienzan a segregar componentes extracelulares (genes srtA, pili, welE, msa y gadph), lo que las fija de forma más estable y permite su agregación (regulado por el gene bfrk, si el mecanismo de adhesión depende de saca- rosa). A medida que proliferan (gen ccpA), las bacterias inician la formación de la biopelícula, mediante la secreción de polisacáridos (genes epsD e inu). Durante este proceso, se comunican mediante señales químicas (quórum sensing, gen luxS), lo que les permite coordinar su crecimiento y organizar la estructura de la biopelícula.

Figure 3. Hypothetical activation model of specific genes controlling bio- film development and progression. Free (planktonic) bacteria approach and adhere reversibly to a surface. Next, they begin to secrete extracellular com- ponents (srtA, pili, welE, msa, and gadph genes), which anchor them more stably and allow their aggregation (regulated by the bfrk gene if the adhe- sion mechanism depends on sucrose). As they proliferate (ccpA gene), the bacteria initiate the formation of the biofilm through the secretion of poly- saccharides (epsD and inu genes). During this process, they communicate via chemical signals (quorum sensing, luxS gene), allowing them to coordinate their growth and organize the biofilm structure.

una subsecuente formación de las biopelículas (Lebeer et al., 2012). La secuencia nucleotídica del gen anotado como Prepilin-type N-terminal se encuentran altamente conserva- do entre ambas subespecies, sin embargo, no se encuentran en la misma posición del genoma, esto podría ser explicado debido a que los genomas bacterianos pueden cambiar drás- ticamente en tamaño, repertorio de genes y sintenia entre las diferentes cepas o linajes ambientales (Cuadros-Orellana et al., 2007).

La secuencia peptídica identificada de la pilina per- tenece a la familia de la proteína de competencia ComGC, presenta un motivo de metilación procariota N-terminal. Estos resultados sugieren que la proteína determinada po- siblemente sea una pilina tipo IV, las cuales se definen por un motivo de secuencia N-terminal conocido como péptido señal de clase III (Giltner et al., 2012). Esta proteína se encuen- tra en la mayoría de las bacterias confiriendo una variedad de funciones, incluyendo adhesión, motilidad, secreción de proteínas y absorción de ADN (Sheppard et al., 2020).

Adicionalmente Laurenceau et al. (2013) reportó que las proteínas tipo pilina están compuestas principalmente por la subunidad mayor (comGC) y se ensamblan mediante una maquinaria simple compuesta por cuatro pilinas menores (comGD, comGE, comGF y comGG), una pre-pilina peptidasa (comC), una extensión ATPasa (comGA) y una proteína de pla- taforma (comGB). Los hallazgos encontrados en el presente estudio sugieren la presencia del gen codificante a una pilina de tipo IV en L. delbrueckii subsp. bulgaricus y L. delbrueckii subsp. lactis como estructura de adherencia. Esta misma, al ser una proteína de competencia podría estar potencial-

mente relacionada con el mecanismo de adquisición de ADN exógeno, siendo este un componente principal de las biope- lículas, razón que puede explicar el fenómeno de adherencia. Adicionalmente, los pili de tipo IV son esenciales en una gran diversidad de especies bacterianas, ya que contribuyen a distintos procesos como la motilidad espasmódica, compe- tencia natural, formación de biopelículas o microcolonias y adhesión de células huésped (Ronish et al., 2019).

Por otro lado, el gen srtA que codifica a la sortasa de clase A se identificó en el 100 % de los genomas de estudio (Tabla 3). De acuerdo con Guiton et al. (2009), factores como las sortasas, la autolisina y el ADN extracelular se han asociado a la producción de las biopelículas. Evidencias experimentales

revelan que, cuando es eliminado el gen srtA, se ve afectada la etapa de maduración de las biopelículas en Enterococcus faecalis. En Lactobacillus plantarum una deleción génica en el gen srtA muestra una disminución en la adherencia a las células epiteliales y perdida de la capacidad para formar biopelículas (Malik et al., 2013).

El gen srtA se identificó en una unidad transcripcional que comprende los genes hrcA, dnaK, dnaJ, lepA y recJ. Dichos genes han sido relacionados con la formación de biopelículas en algunas especies del género Lactobacillus. En correlación con De Angelis et al. (2015) cuando L. plantarum DB200 forma su biopelícula, se incrementan los niveles de algunas proteínas de estrés como DnaJ y GroEL. Los altos niveles de estas proteínas pueden contribuir a una mayor su- pervivencia de las células en condiciones de estrés por calor (De Angelis et al., 2015) y ejercer protección cruzada frente a otros choques ambientales (De Angelis et al., 2004). Además, dichas proteínas también muestran propiedades adhesivas e inmunomoduladoras (Pessione, 2012).

En la actualidad, no existen reportes en la literatura sobre proteínas de biosíntesis de homopolisacáridos en los genomas de estudio (L. delbrueckii subsp. bulgaricus y L. del- brueckii subsp. lactis). Sin embargo, al realizar un análisis del tipo BLASTX utilizando la secuencia codificante de la Inulo- sacarasa de L. reuteri TMW 1106.1 se reveló la presencia de 4 proteínas homólogas de las cuales dos son glicosil hidrolasas, una levansacarasa y una proteína hipotética (Tabla 4). L. reu- teri es una bacteria ácido-láctica formadora de biopelículas que se ha encontrado con mayor prevalencia en individuos con obesidad que en individuos con normopeso (Million et al., 2012). Adicionalmente, Jones y Versalovic (2009) demos- traron que la biopelícula formada por L. reuteri modula la producción de citocinas y produce sustancias antiinflama- torias. Estos resultados indican que, solo algunas cepas per- tenecientes a L. delbrueckii subsp. bulgaricus y L. delbrueckii subsp. lactis contienen al menos una proteína relacionada a la síntesis de homopolisacáridos. Para el caso particular de L. delbrueckii subsp. lactis DSM 20072 se identificó una proteína compuesta por 1091 aminoácidos denominada levansaca- rasa, por lo que se podría inferir que el homopolisacárido sintetizado por dicho microorganismo es una fructana de tipo levana. Este resultado es altamente significativo, puesto que las especies pertenecientes al grupo de Lactobacillus

delbrueckii presentan genomas muy similares, de hecho, no se pueden diferenciar al utilizar la secuencia del rrs que codifica el RNA 16S. Nuestro hallazgo confirma la existencia de un gen específico de cepas asociado al metabolismo de los carbohidratos responsables de catalizar la formación de polímeros de fructosa ya sean lineales o ramificados a partir de sacarosa (Tieking y Gänzle, 2005).

Según Schwab et al. (2007) la inactivación de los genes inu y ftfA (codifica una levansacarasa) elimina por completo la síntesis de homopolisacáridos en L. reuteri TMW1.106 y L. re- uteri LTH5448. Además, evidencias experimentales postulan que estos genes confieren importantes atributos ecológicos a L. reuteri TMW1.106 ya que, contribuyen a la colonización en el tracto gastrointestinal del huésped (Walter et al., 2008). Identificar secuencias homologas de estos genes en las es- pecies L. delbrueckii subsp. bulgaricus y L. delbrueckii subsp. lactis es de suma importancia, ya que, pudieran cumplir una función similar en la síntesis de exopolisacáridos y en el pro- ceso de adherencia a las células epiteliales del intestino.

Los heteropolisacáridos se caracterizan por ser sinte- tizados mediante la acción conjunta de un grupo de genes denominados eps, los cuales se pueden localizar tanto en plásmidos como en el cromosoma bacteriano (Caggianiello et al., 2016). Estos genes han sido reportados en Streptococ- cus thermophilus, Lactococcus lactis y Lactobacillus sp. (Ruas- Madiedo, 2009). En el presente estudio se identificó el gen epsD con las coordenadas genómicas 1683916-1694141 en L. delbrueckii subsp. bulgaricus 2038. Dicho gen se encontraba inmerso en una unidad transcripcional policistrónica com- puesta por los genes epsA, epsB, epsC, epsD, epsF, epsG, epsJ, epsK, epsM, entre otros, presentando una extensión aproxi- mada de 10.5 Kb. En conformidad con Zeidan et al. (2017) los grupos de genes eps (u operones) tienen un tamaño de 15 a 20 Kb y comprenden menos de 30 genes.

El presente estudio encontró cierta variabilidad en la extensión y composición del operón eps entre L. delbrueckii subsp. bulgaricus y L. delbrueckii subsp. lactis. Una posible explicación de este resultado se debe a que el programa Operon-mapper se basa en la distancia intergénica de genes vecinos y en las relaciones funcionales de sus productos codificantes. Por lo que una distancia intergénica mayor a la que detecta el programa pudo discriminar la cantidad de genes presentes en el operón con respecto a lo reportado en la literatura. De forma general se ha descrito que, en las Bacterias Ácido Lácticas, los genes que conforman el operón eps suelen tener la misma orientación y se transcriben como un solo ARN mensajero (Lamothe et al., 2002). Esta postula- ción coincide con los resultados obtenidos en el presente estudio, ya que, el operón responsable de la síntesis de EPS se encuentra en la misma dirección tanto en L. delbrueckii subsp. bulgaricus 2038 como en L. delbrueckii subsp. lactis DSM 20072.

Adicionalmente, Hao et al., 2011 menciona que, el grupo de genes eps propio de la cepa L. delbrueckii subsp. bulgaricus 2038 muestra diferencias significativas contra L. delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC11842 y L. delbrueckii subsp. bulgaricus

BAA365 con respecto a la ganancia y pérdida de algunos ge- nes que codifican glucosiltransferasas. Por lo tanto, la unidad de repetición EPS producida por los grupos de genes de la cepa 2038 debe ser diferente de la ATCC 11842 y BAA365 asu- miendo que cada cepa sintetiza un heteropolisacárido único. Si bien se necesitan múltiples productos genéticos para el desarrollo de biopelículas, en Bacillus subtilis la de- cisión de cambiar de un estado planctónico de vida libre a un estado de formación de biopelículas se rige por SinR, el regulador transcripcional maestro de la formación de biope- lículas (Newman et al., 2013). Los resultados de la presente investigación mostraron 3 proteínas con porcentajes de identidad significativos contra SinR con el nombre Helix- turn-helix transcriptional regulator y los códigos de accesos WP_099279028.1, WP_072547665.1 y WP_072547106.1.

De acuerdo con Branda et al. (2001), SinR es un represor transcripcional que se une a la región promotora del operón responsable de la biosíntesis de exopolisacáridos EpsA-O.

A pesar de haber detectado 3 proteínas homologas, únicamente WP_099279028.1 presenta como genes vecinos a proteínas asociadas a la biosíntesis de exopolisacáridos como, por ejemplo, glucosiltransferasas, hecho que nos brin- da la posibilidad de inferir que este regulador transcripcional esta potencialmente relacionado en la regulación del operón eps en L. delbrueckii subsp. bulgaricus y L. delbrueckii subsp. lactis.

Además de la proteína SinR, se han identificado otros factores de transcripción que están relacionados con la regulación de algunos genes durante el cambio en el estilo de vida de un estado planctónico al sésil. Entre ellos, ccpA, un regulador transcripcional clave de la respuesta a la limita- ción de carbohidratos inicialmente descrito en L. plantarum (Muscariello et al., 2013). Por otro lado, se ha reportado que la proteína BrpA regula el desarrollo de biopelículas en S. mutans (Wen et al., 2006).

Los elementos regulatorios que actúan en cis se pueden definir como una secuencia de ADN no codificante respon- sable de la transcripción de los genes cercanos (Wittkopp et al., 2012). El descubrimiento de este tipo de secuencias puede desempeñar un papel crucial en el descifrado de las secuencias del genoma y en la interpretación de los datos del transcriptoma (Defrance et al., 2008). Se han empleado una gran diversidad de enfoques para la identificación de elementos que actúan en cis entre especies. Algunos de ellos se basan en la identificación de patrones en especies evolutivas considerablemente distantes (Alkema et al., 2004) y algunos otros en la comparación de especies directamente relacionadas (Yan et al., 2004).

En el presente estudio se identificaron dos motivos al-

tamente significativos, GCTGGA y GAATGGTC en las regiones corriente arriba de los genes conservados y las unidades transcripcionales predichas en los diferentes genomas de L. delbrueckii subsp. bulgaricus y L. delbrueckii subsp. lactis (Fi- gura 2). Este tipo de análisis bioinformático se ha empleado para la detección de motivos de unión específicos en L. plan- tarum en el que se detectaron 6 patrones de secuencia en la

región corriente arriba de genes asociados al metabolismo de fructooligosacáridos (Chen et al., 2015), resultados que posteriormente fueron confirmados mediante ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y análisis de cam- bio de movilidad electroforética (EMSA). Este resultado es altamente significativo para dar pie al diseño de protocolos experimentales que permitan reafirmar los motivos de unión detectados mediante análisis bioinformáticos.

CONCLUSIONES

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacillus de- lbrueckii subsp. lactis son dos subespecies dentro del grupo de Lactobacillus delbrueckii con genes altamente conserva- dos. El presente estudio demuestra que ambas subespecies presentan elementos genómicos para formar biopelículas, especialmente los genes relacionados a mecanismos de ad- hesión (pili y srtA) y síntesis de exopolisacáridos (inu y epsD), correspondientes a las etapas de adherencia y maduración de las biopelículas.

Los genes pili, epsD y srtA forman parte de unidades transcripcionales policistrónicas conservadas, por lo que es necesario realizar estudios enfocados a revelar qué estímulos ambientales y redes de interacción biológica están vincula- dos a la formación de biopelículas. A pesar de que los genes identificados presentan porcentajes de identidad superiores al 95 % entre subespecies, la posición genómica es altamente variable, lo que revela que los genomas estudiados son alta- mente dinámicos y pueden cambiar el repertorio de genes entre las diferentes cepas o linajes ambientales.

Independientemente de que las especies L. delbrueckii subsp. bulgaricus y L. delbrueckii subsp. lactis se han utilizado ampliamente en aplicaciones biotecnológicas e industria alimentaria, se dispone de información limitada sobre el mecanismo de regulación genética de formación de las biopelículas. Los análisis realizados demostraron que las especies de estudio contienen un factor de transcripción potencialmente vinculado con el control transcripcional de genes, cuyo producto son proteínas de biosíntesis de exopo- lisacáridos y otras enzimas fundamentales en la formación de biopelículas. Por lo tanto, se infiere que deben existir vías reguladoras mediadas por reguladores transcripcionales y condiciones ambientales que deben ser dilucidadas.

Los patrones de secuencia de ADN detectados río arriba de los operones vinculados a la formación de biopelículas demostraron ser estadísticamente significativos, los datos generados en este análisis pueden ser importantes para futuros protocolos experimentales. Los análisis de predicción de elementos reguladores en cis pueden identificar subcon- junto de genes co-regulados inmerso en un subgrupo más extenso de genes co-expresados, lo que permitirá esclarecer el estado de la red reguladora y reconocer las señales am- bientales a las que reacciona el microorganismo.

CONFLICTOS DE INTERÉS

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

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